Queremos expressar gratidão aos funcionários do Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Universidade Estadual de Iowa, ou seja, Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green e Jennifer Groeltz-Thrush, pelo processamento oportuno das amostras. Também gostaríamos de agradecer a Jodi Smith e Bethann Valentine por fornecer material para os experimentos de permeabilidade. Também queremos agradecer a David Diaz-Reganon por sua ajuda com a Figura 9. Com exceção da Figura 6, todos os números foram criados em BioRender.com. Os autores desejam reconhecer o apoio da Startup da Faculdade, isu VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award e NSF SBIR subaward para ISU # 1912948.

K. Allenspach é co-fundador da LifEngine Animal Health e da 3D Health Solutions. Atua como consultora na Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probitics e Mars. J.P. Mochel é co-fundador da LifEngine Animal Health e da 3D Health Solutions e atua como consultor da Ceva Animal Health e ethos Animal Health. Este artigo reflete as opiniões dos autores e não deve ser interpretado para representar o endosso, visão ou políticas da Food and Drug Administration. Outros autores não têm qualquer conflito de interesse para declarar.

Culturas organoides intestinais caninas no aparelho de suporte permeável são um conceito único que conecta os ensaios tradicionais de permeabilidade de drogas40 com um novo modelo canino in vitro 41. Diferentes tipos de organoides intestinais caninos podem ser usados e avaliados com base no objetivo do experimento com ajustes mínimos. Recomenda-se testar múltiplas concentrações da droga de interesse em 3-4 poços por grupo. As concentrações podem ser baseadas na concentração intestinal esperada da droga. Além disso, o uso de pesquisas anteriores pode ajudar a determinar os pontos de tempo apropriados para o desenho do estudo. A documentação adequada do projeto do estudo deve ser feita para aumentar a replicabilidade e auxiliar na solução de problemas.
Essa tecnologia tem várias limitações devido à novidade do método42, principalmente pela falta de padronização no design experimental e execução do protocolo entre laboratórios. Essa falta de padronização tem sido reconhecida por outros grupos43, e os Protocolos Monocamadas Organoides 3D caninos levarão à reprodutibilidade interlaboratória e introduzirão a padronização desse sistema. Abordagens padronizadas para análise de dados melhoram a replicabilidade e podem fortalecer os resultados de testes preliminares de drogas usando os organoides caninos no sistema de suportes permeáveis em diferentes laboratórios. O modelo organoide 3D canino também carece de conjuntos de dados comparando valores in vitro deaplicativos P de drogas modelo com sua conhecida absorção intestinal humana ou canina, assim como células Caco-2 44,45,46. Uma vez gerados esses dados, este modelo organoide canino pode ser utilizado para avaliar a permeabilidade intestinal durante o desenvolvimento de medicamentos.
É crucial que se cuide ao semear os organoides no sistema de suporte permeável para semear uma densidade suficiente de células adequadamente dissociadas. Os valores TEER do sistema são mais confiáveis e reprodutíveis quando cultivados em monocamadas estritas. A cultura prolongada das monocamadas pode levar a um aumento exponencial dos valores do TEER que atingem ainda mais os valores fisiológicos do intestino. Seções de H&E dessas estruturas 3D mostram várias camadas de células acima umas das outras com estruturas alteradas de enterócitos mais próximas da membrana.
Após a expansão bem sucedida da monocamada organoide intestinal canina, os resultados podem ser analisados da mesma forma que os ensaios tradicionais de células 2D calculando a fórmula 44 do coeficiente de permeabilidade aparente de uma droga (p) fórmula44. O valordo aplicativo P (ver Eq (2)) descreve a taxa de transporte através da monocamadas celular47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
A <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> inclinação inicial da concentração versus a curva de tempo (por exemplo, nmol/s). A é a área da inserção (cm2), e C0 é a concentração inicial da droga ou composto na câmarade doadores 37. O reconhecimento confiável da integridade da monocamada é uma parte crucial do ensaio de permeabilidade que exige padronização. Microscopia leve e medidas de TEER são recomendadas para avaliar organoides caninos em um sistema de suporte permeável e ajudar a determinar o tempo correto do experimento. Além disso, marcadores de permeabilidade molecular zero (por exemplo, FITC-dextran, amarelo Lúcifer, PEG-400) podem ser usados para avaliar funcionalmente a integridade da monocamada organoide. Deve-se prestar atenção se o composto testado for afetado por um transportador. P-glicoproteína (P-gp) é usada como um exemplo comum de bomba efflux. Uma razão efflux deve ser gerada (aplicativo P, aplicativo BL-AP/P, AP-BL) em comparação com um conhecido substrato de teste P-gp.
Microscopia leve (simples ou aprimorada com contraste de fase) é um método inestimável para verificar a integridade da monocamada 2D ou 3D e a inserção do filtro enquanto avalia possível crescimento excessivo celular. A Figura 7 pode servir como um guia para reconhecer culturas saudáveis de células organoides intestinais caninas. Os valores teer são uma medida importante da formação de junções intercelulares e diferenciação das culturas organoides em um epitélio intestinal intacto. Os organoides intestinais caninos se diferenciam em enterócitos e células de cálice (Figura 6). Essas células produtoras de muco permitem o estudo de interações medicamentoso-muco, que tem sido difícil de alcançar usando culturas tradicionais de células 2D48. A presença de células enteroendócrinas foi previamente confirmada em organoides intestinais caninos por Chandra et al.33.
Outra caracterização das monocamadas organoides caninas derivadas de organoides jejunas, ileais e coloniais utilizando TEM é fornecida. As imagens tem mostram microarquitetura celular, incluindo junções apertadas e formação de microvilli, ilustrando ainda mais a complexidade e a utilidade desses modelos organoides na medicina translacional. Com base nos resultados experimentais, as culturas organoides no suporte permeável estavam prontas para experimentação entre os dias 11 e 13 pós semeadura (Figura 9). Os valores do TEER neste momento variaram entre 1.500 e 2.500 Ω,cm2. A fase de platô dos valores teer dura uma janela de tempo muito limitada onde o experimento deve ser iniciado antes que os valores teer comecem a diminuir lentamente. Os valores do TEER também podem ser uma parte crucial da exibição de resultados experimentais importantes, pois algumas drogas ou excipientes de produtos medicamentosos podem interagir com a monocamada (por exemplo, junções apertadas), o que pode afetar muito as leituras de valor do TEER. Isso por si só pode servir de dados para um experimento.
Organoides intestinais caninos em um aparato de cultura celular de câmara dupla podem ser aplicados em campos que não a permeabilidade da droga oral devido à arquitetura única da monocamada celular resultante. Por exemplo, eles podem ser usados em pesquisas de microbiologia (por exemplo, o impacto da alteração da flora microbiana de GI), estudos de absorção viral, interações medicamentosa-medicamentos e mecanismos de transporte de drogas49. A câmara de doadores é tipicamente preenchida com a droga de teste ou composto de escolha, e alíquotas da câmara receptora são tomadas em vários pontos de tempo. Essas alíquotas podem ser analisadas usando cromatografia líquida de alto desempenho, espectrometria de massa, ensaio imunossorbente ligado à enzima ou outras técnicas para determinar a quantidade e a velocidade pelas quais o soluto permeia através da monocamada.
Estes estudos requerem uma monocamada intacta para avaliar a permeabilidade da droga com precisão. Isso normalmente requer monocamadas crescentes em excesso às necessárias para contabilizar poços inutilizáveis. Monocamadas de células organoides também podem ser usadas para medir a absorção viral do lado apical ou basal de uma monocamada, com leituras incluindo ensaios de imunofluorescência que utilizam anticorpos para detectar a absorção celular do vírus. Finalmente, vários medicamentos (ou seja, substrato e inibidor) podem ser aplicados na câmara de doadores para identificar interações medicamentosas baseadas em transporte.
Com base nas observações atuais, esses métodos não serão apenas aplicáveis aos organoides caninos nas pastilhas culturais, mas também serão adequados para outras espécies veterinárias e sistemas de órgãos, com pequenas modificações necessárias para melhor se adequar à espécie ou modelo de órgão de escolha. Os protocolos para o crescimento organoide intestinal canino tiveram que ser ajustados com base nas propriedades únicas da cultura. Assim, o protocolo pode ser ajustado para outra espécie, mas exigirá mudanças sutis no protocolo. As modificações podem começar com alterações na densidade de semeadura celular e expandir-se para mudanças na composição da mídia para diferenciar adequadamente os organoides de interesse.
A padronização, a documentação detalhada dos procedimentos experimentais e o monitoramento consistente das monocamadas celulares são práticas cruciais necessárias em todos os ensaios de suporte permeáveis e não se limitam ao sistema canino. Essas possíveis modificações de espécies ou órgãos são fundamentais para documentar e relatar novos avanços no campo. Este modelo tem várias limitações, por exemplo, seus requisitos de custo, variabilidade interlaboratória e dados limitados sobre a capacidade de prever a absorção intestinal in vivo. Os cães, em alguns casos, possuem diferentes transportadores de drogas e enzimas metabolizantes do que os humanos50.
Além disso, o sistema organoide canino deve ser testado em uma variedade de outros aparelhos de câmara dupla de outros fabricantes para determinar a adequação de tal modelo (por exemplo, a adequação de diferentes composições de membrana de filtro deve ser determinada). Outra desvantagem é que a parte do experimento de permeabilidade da droga do manuscrito é menos descritiva do que as partes anteriores. Isso é causado por um excesso de informação neste campo. O objetivo desta parte do manuscrito era descrever esses métodos de forma modificável, sem cortar as bordas dos pilares desses experimentos. Informações mais detalhadas sobre experimentos de permeabilidade foram coletadas por Hubatsch et al.37. Além disso, as pastilhas permeáveis podem ser usadas em experimentos de cocultura, migração celular e ensaio de invasão4.
Em conclusão, os organoides intestinais caninos em aparelhos de cultura de câmara dupla têm o potencial de serem usados em uma ampla gama de aplicações, incluindo campos biomédicos e medicina translacional, para citar alguns. Os protocolos criam várias estratégias para planejar um experimento e promover a confiabilidade de dados interlaboratoriais para modelos organoides em todo o campo da biologia.

Sistemas de suporte permeáveis são tipicamente usados para determinar a aparente permeabilidade dos candidatos a medicamentos terapêuticos através da barreira epitelial intestinal 1,2. Eles também podem ser empregados para avaliar a secreção celular3, migração celular4 e toxicidade de drogas5. Ensaios de permeabilidade de medicamentos orais in vitro são um passo fundamental no processo de descoberta e desenvolvimento de drogas2, com candidatos individuais a medicamentos sendo testados na fase inicial do ciclo de vida da droga P&D6. O sistema de suporte permeável é um aparelho de cultura celular de câmara dupla que consiste em uma inserção com uma membrana semiporosa colocada em uma placa multiwell. Este sistema permite acesso direto aos lados apical e basolateral de uma monocamada celular cultivada na pastilha7. A monocamada usada nesses sistemas é tipicamente derivada de células epiteliais gastrointestinais (por exemplo, linha celular colorretal humana Caco-2)8. Culturas celulares crescem em um estado polarizado imitando a microarquitetura natural das células epiteliais intestinais, permitindo maior diferenciação celular, microanato semelhante e função7. Os detalhes da inserção de suporte permeável podem ser encontrados na Figura 1. A semeadura das pastilhas com culturas celulares 2D, tradicionalmente utilizadas para avaliar a permeabilidade de medicamentos intestinais, é relativamente acessível e fácil de cultivar9. Esses sistemas apresentam várias limitações importantes, incluindo sua capacidade limitada de prever o metabolismo intestinal dos candidatos a medicamentos terapêuticos10,11. Isso é verdade para todos os mecanismos de absorção de drogas, seja absorção passiva através das junções apertadas entre as células epiteliais, absorção transepitel ativa através de efflux, ou transportadores de captação (por exemplo, P-glicoproteína, transporte monocarboxilato 1), e drogas metabolizadas por enterócitos.
Os cães compartilham um ambiente comum e dieta com humanos12. Anatomia intestinal canina e a composição do microbioma se assemelham muito à dos humanos13, que tem sido atribuída à domesticação e dietas compartilhadas nos últimos 36.000 anos14. Infelizmente, essas semelhanças também podem ser causas/gatilhos comuns para o desenvolvimento de doenças. Os cães desenvolvem morbidades crônicas semelhantes aos seres humanos, como obesidade15, doença inflamatória intestinal16, adenocarcinoma colorretal17, tumor estromal gastrointestinal (GIST)18, e várias outras patologias associadas à sua relativa longevidade19. Assim, os organoides caninos podem ser utilizados com sucesso para pesquisas translacionais reversas dessas doenças multifatoriais crônicas no espírito da One Health Initiative20.
As células caco-2 são as linhas celulares mais usadas para ensaios de absorção oralde drogas 21. Essas células são atualmente consideradas o modelo "padrão-ouro" para ensaios in vitro de permeabilidade intestinal 2,22,23. A linha celular Caco-2 expressa transportadores efflux e de absorção encontrados no trato intestinal humano, embora em diferentes níveis de expressão 24,25,26. As células caco-2 também são amplamente utilizadas como modelos para determinar se uma droga é um substrato ou inibidor de transportadores efflux intestinais22,27. Embora as células Caco-2 sejam de origem colonica, elas imitam uma célula enterócito. Infelizmente, as células caco-2 representam apenas um tipo de célula da camada epitelial do intestino delgado9, que não consegue recapitular a complexa composição do tipo de célula epitelial intestinal com precisão. Por exemplo, células de cálice dedicadas à produção de muco estão ausentes das culturas Caco-2, de tal forma que as interações muco-droga não podem ser avaliadas sem cocultura com outras linhascelulares 28. Além disso, as culturas caco-2 não expressam vários dos importantes receptores nucleares tipicamente presentes no intestino, como o receptor pregnane X (PXR), o receptor de esteroides X (SXR) e o receptor androstane constitutivo (CAR)29. Consequentemente, as culturas caco-2 não conseguem modelar a indução de transportadores de drogas e enzimas por certas drogas que são indutores desses receptores (por exemplo, rifampin)30.
A tecnologia organoide intestinal 3D aborda algumas dessas limitações19. Organoides são construções auto-montadas derivadas de células-tronco adultas que podem ser estabelecidas a partir de amostras de tecido colhidas usando técnicas microinvasivas20. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem estão sendo empregadas para modelos de permeabilidade intestinal31,32. Os organoides caninos fornecem uma alternativa relevante aos organoides humanos porque a pesquisa de células-tronco humanas é restrita por questões éticas33. Além disso, os organoides caninos fornecem um sistema in vitro para explorar a permeabilidade de drogas caninas, metabolismo, transporte ativo e interações medicamentosas. Para suprir essa lacuna tecnológica, foi descrito34 o crescimento consistente e confiável dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável. Um ensaio de permeabilidade com organoides intestinais caninos pode potencialmente prever a permeabilidade intestinal canina e o metabolismo de pequenas moléculas de drogas em comparação com ensaios atualmente usados (Caco-2). A confirmação dessas características fundamentais dá este novo sistema in vitro para trabalhos futuros explorando o impacto potencial dos indutores no metabolismo intracelular e no transporte ativo.
Os organoides caninos são compostos de todos os tipos de células tipicamente presentes na camada epitelial do intestino. A partir de uma visão funcional e microanatópica, eles replicam de forma confiável o ambiente da camada epitelial do intestino canino 19,35. Além disso, a presença de muco, transportadores e enzimas de drogas específicas da canina e a diferenciação celular geral em organoides intestinais caninos é comparável ao que é visto in vivo em cães34. Assim, os organoides podem ser isolados de pacientes veterinários doentes e utilizados para modelar o efeito de vários processos da doença (por exemplo, inflamação intestinal crônica) na permeabilidade da droga oral canina19,36. O sistema organoide intestinal canino também pode ser usado em outras configurações do que experimentos de permeabilidade de drogas. Essas estruturas 3D também podem ser isoladas de pacientes doentes como descrito anteriormente por Chandra et al. para doença inflamatória intestinal, adenocarcinoma colorretal e tumor estromal gastrointestinal19.
O Protocolo de Sementes de Suporte Permeável descreve métodos para estabelecer culturas organoides intestinais caninas nas pastilhas. Este primeiro protocolo descreve métodos para dissociar culturas organoides caninas estabelecidas banhadas na matriz de membrana extracelular. Além disso, o pré-revestimento das pastilhas com colágeno I e a matriz de membrana extracelular é discutido neste protocolo. A incorporação de organoides caninos nas pastilhas de suporte permeáveis também é descrita em detalhes.
O segundo protocolo é o Protocolo de Manutenção de Monocamadas, que inclui a manutenção geral de organoides 3D caninos emplacados em uma inserção. A frequência e os volumes da mídia organoide utilizada para refrescar a cultura, e formas de prevenir danos à cultura celular, são apresentados neste segundo protocolo, juntamente com métodos experimentais para avaliar a confluência da monocamada epitelial.
Finalmente, o Protocolo Experimental de Permeabilidade se concentra em maneiras de determinar se os organoides 3D intestinais caninos em um ensaio de permeabilidade estão prontos para uso experimental e as etapas de verificação necessárias antes de realizar qualquer experimento. Esta seção também descreve a configuração e a execução bem sucedida de um experimento de permeabilidade, juntamente com a incubação e amostragem de candidatos a medicamentos terapêuticos nas câmaras da cultura monocamada. Também é discutido o uso do isothiocyanato de fluoresceína de baixa permeabilidade (FITC-dextran) para monitorar a integridade da monocamada. Finalmente, um método de avaliação in vitro para validação dos resultados após a conclusão de um experimento é descrito. Os experimentos de permeabilidade são um tema extremamente vasto e são muito bem resumidos por Hubatsch et al.37. O fluxo de trabalho dos protocolos é resumido na Figura 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Figura 1: Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável. A inserção de suporte permeável está posicionada em um poço de uma placa de 24 poços. A membrana microporosa permite a semeadura de organoides intestinais caninos dissociados, e essas células eventualmente formarão uma monocamada organoide 2D. Esta tecnologia permite o acesso tanto aos lados AP quanto BL da monocamheira. O meio organoide é introduzido nas câmaras AP e BL do suporte permeável. A absorção (AP→BL) e a secreção (BL→AP) do candidato à droga são ilustradas, bem como dois modos possíveis de transporte de drogas. Abreviaturas: AP = apical; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho de protocolos de suporte permeáveis organoide canino. A inserção de suporte permeável é pré-revestida com uma mistura da matriz de membrana extracelular e colágeno I e incubada por 1h. Durante o processo de incubação, a cultura organoide é dissociada. As células organoides individuais são semeadas na inserção, o meio na câmara basolateral é adicionado imediatamente após a semeadura, enquanto o médio à câmara apical é adicionado 24h após o processo de semeadura concluído. A manutenção e o monitoramento dos organoides incluem alterações médias regulares, medidas de valor TEER e microscopia leve para avaliar a integridade da monocamada. Antes do experimento, os organoides devem ser diferenciados removendo o inibidor rock e gskiβ da mídia. Os valores do TEER são medidos no dia do experimento, e a monocamada organoide é inspecionada através de microscopia leve para danos às células. O medium é então trocado por um buffer apropriado e incubado antes do experimento. O ensaio FITC-dextran é usado durante experimentos de permeabilidade intestinal39 como um marcador de integridade de monocamadas. As medições de TEER são tomadas após o experimento, e a microscopia leve validará os resultados após 24 horas. Abreviaturas: TEER = resistência elétrica transepitelial; ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; F = fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

O sistema de suporte permeável é tipicamente usado em conjunto com as tradicionais linhas celulares bidimensionais (2D) como uma ferramenta in vitro para avaliar a permeabilidade oral de novos candidatos a medicamentos terapêuticos. No entanto, o uso dessas linhas celulares convencionais tem limitações, como expressão alterada de junções apertadas, diferenciação celular parcial e ausência de receptores nucleares chave. Apesar dessas deficiências, os modelos Caco-2 e MDCK são amplamente aceitos e validados para a previsão da permeabilidade oral in vivo humana.
Os cães são um modelo translacional relevante para pesquisas biomédicas devido às suas semelhanças na anatomia gastrointestinal e na microflora intestinal com humanos. Assim, e em apoio ao desenvolvimento paralelo de medicamentos, a elaboração de uma ferramenta in vitro eficiente e precisa para prever características in vivo de permeabilidade de medicamentos tanto em cães quanto em humanos é altamente desejável. Tal ferramenta poderia ser o sistema organoide intestinal canino, caracterizado por estruturas epiteliais tridimensionais (3D), auto-montadas derivadas de células-tronco adultas.
O (1) Protocolo de Sementemento de Suporte Permeável descreve os métodos experimentais para dissociar e semear organoides caninos nas pastilhas. O isolamento, a cultura e a colheita organoides caninas foram previamente descritos em um conjunto separado de protocolos nesta edição especial. Os métodos de manutenção geral da monocamada organoide intestinal canina são discutidos minuciosamente no (2) Protocolo de Manutenção de Monocamadas. Além disso, este protocolo descreve métodos para avaliar a integridade estrutural da monocamadas através de medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) e microscopia leve. Finalmente, o (3) Protocolo Experimental de Permeabilidade descreve as tarefas diretamente anteriores a um experimento, incluindo validação in vitro de resultados experimentais.
No geral, o modelo organoide canino, combinado com uma tecnologia de cultura celular de câmara dupla, supera limitações associadas a modelos experimentais 2D, melhorando assim a confiabilidade das previsões da aparente permeabilidade oral dos candidatos a medicamentos terapêuticos tanto no paciente canino quanto no humano.

Procedimentos operacionais padrão para a cultura dos organoides caninos foram previamente descritos33, e o Protocolo Organoide Canino também foi discutido detalhadamente nesta edição especial38. Organoides intestinais caninos cultivados em suportes permeáveis foram fixos e incorporados para parafina para examinar a micronatomia da monocamada e das populações celulares. O processo de incorporação de parafinas foi previamente discutido por Gabriel et al.38. A coloração de rotina (hematoxilina e eosina) foi realizada, e a técnica de coloração azul alciana foi usada para detectar células de cálice na monocamada organoide canina (ver Figura 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Figura 7: Coloração monocameira organoide intestinal canina. Organoides intestinais caninos de origem colonica no suporte permeável foram incorporados e manchados com H&E e AB. Imagens representativas foram tiradas usando microscopia leve em 40x (A) e 60x (B). A coloração de H&E revela uma monocamada epitelial colunaar, e os microvilli na parte apical das células podem ser observados na ampliação de 60x. A coloração AB revela ainda a presença de células de cálice (azul escuro) na monocamada organoide intestinal canina. Barras de escala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; AB = Azul Alciano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A cultura organoide no suporte permeável deve ser cultivada por 10 a 14 dias para estar pronta para um experimento de permeabilidade. A microscopia leve é usada em conjunto com as medidas de valor teer para confirmar a prontidão da cultura organoide para testes de permeabilidade de candidatos a medicamentos. Imagens microscópicas leves representativas de diferentes monocamadas organoides caninas de animais saudáveis e doentes são apresentadas na Figura 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Figura 8: Microscopia monocamide organoide intestinal canina. Imagens de monocamadas em crescimento, como visto sob microscopia leve. As monocamadas organoides derivadas de doadores saudáveis são representadas por culturas enteróide jejunal (10x; 40x) e colonóide (20x; 40x). As monocamadas organoides de doadores doentes são representadas por enteróides duodenais (5x; 10x) e ileais (5x; 10x) derivados de um paciente canino diagnosticado com PLE. Ambas as culturas organoides PLE são exemplos de isolamento celular inadequado durante a semeadura de organoides, e essas culturas não poderiam ser usadas para ensaios de permeabilidade de drogas devido à presença de organoides 3D. Exemplos de desvios da formação adequada de monocamadas, como as lágrimas de monocamadas (5x), são causados pela manipulação descarada das amostras biológicas. A cultura prolongada de organoides (10x; 20x) é causada pela longa manutenção dos organoides na inserção quando os organoides começam a se assemelhar à sua estrutura 3D original. Para comparação, são apresentadas imagens de linhas celulares 2D tradicionais nos suportes permeáveis utilizados comumente para estudos de permeabilidade de medicamentos (MDCK-10x; 40x e Caco-2-10x; 20x). Abreviaturas: PLE = enteropatia que perde proteínas; MDCK = Rim canino Madin-Darby. Barras de escala = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As monocamadas organoides também foram fixadas em 3% de paraformaldeído-3% glutaraldeído em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi utilizada para caracterizar a ultraestrutura da cultura organoide nos suportes permeáveis. Estruturas microanatomômicas de microvilli e junções apertadas podem ser vistas na Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Figura 9: Imagens TEM de monocamadas organoides intestinais caninas saudáveis. FOI utilizado para revelar a microarquitetura celular de monocamadas organoides jejunal (A), ileal (B) e coloniais (C). A membrana microporosa da inserção de suporte permeável é marcada com uma seta amarela. A presença de microvilli (seta azul) e junções apertadas (seta vermelha) é delineada nas imagens. Abreviação: TEM = Microscopia eletrônica de transmissão. Barras de escala = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ambas as medições teer e microscopia leve devem ser realizadas para garantir que o sistema esteja pronto para testes de permeabilidade. O ensaio está pronto para uso quando o TEER atingir um estado estável, enquanto a microscopia leve ajudará a excluir danos ou crescimento excessivo dos organoides. Um resumo das medições típicas de TEER de cinco grupos constituídos por enteróides jejunas caninos e colonóides é apresentado na Figura 6.
Tabela 1: Composição de mídia organoide e FAA. A composição completa de CMGF+, CMGF+ R/G e FAA estão resumidas nesta tabela. Abreviaturas: ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ; CMGF+ = Meio completo com fatores de crescimento, mas sem inibidor de ROCHA ou GSKiβ; FAA = ácido-álcool formalítico-acético; EGF =fator de crescimento epidérmico. Esta tabela é adaptada a partir de 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela suplementar 1: Tabela para a anotação do organoide canino o sistema de suporte permeável. Abreviaturas: TEER = resistência elétrica transepitelial; ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ; CMGF+ = Meio completo com fatores de crescimento, mas sem inibidor de ROCHA ou GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a cultura dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla. São descritos os suportes permeáveis, a manutenção da monocamada e os experimentos subsequentes de permeabilidade de drogas.

Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

The combination of canine organoid technology and a dual chamber permeable support system overcomes the limitations of experimental 2D cell lines traditionally used in biomedical research models.The technology can increase the reliability of predictions of the apparent oral permeability of therapeutic drug candidates both in canine and human patients.The system can be applied to other fields of biomedical research including microbiology research, viral uptake studies, drug-drug interactions, and drug transport mechanisms.The standardization, detailed documentation of experimental procedures and consistent monitoring of the cell monolayers are crucial practices needed for the permeable support assays.Place the extracellular membrane matrix on ice to begin thawing.Submerge it in ice to protect against rapid thawing and avoid solidification.Pre-chill a refrigerated centrifuge to 4

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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