このプロトコルにより、ダニの数を減らすことができ、コロニーの維持コストを削減し、ダニの摂食に必要な椎骨動物の数を減らすことができます。このプロトコルには約 20 ティックが必要です。ただし、小さなサンプルサイズを使用することを除けば、このプロトコルを複数のダニ種と異なるライフステージに適用できることが主な利点です。
ダニの解剖や宿主と寄生虫の相互作用への応用は別として、マイクロRNA分泌に対する病原体感染の影響とダニによって分泌されるマイクロRNAに対する生理学的変化の影響。まず、ウシ胎児血清、トリプトースリン酸ブロス、10%リポタンパク質コレステロール濃縮物、5%重炭酸ナトリウム、HEPES、およびL15C300培地を26.3ミリリットルのポリカーボネート遠心分離機ボトルに追加して、小胞を含まない培地を準備し、必要に応じて容量を調整します。次に、培地を摂氏4度で100, 000倍Gで18時間超遠心分離します。
ペレットを乱さずに上清を注意深く取り除き、上清を新しい遠沈管に移します。チューブをもう一度超遠心分離します。上清を取り、0.22マイクロメートルのフィルターに通して汚染物質を除去します。
上清を50ミリリットルの遠心チューブにピペットで入れ、必要になるまで摂氏マイナス20度または最長3年間保管します。24ウェル培養プレートの各ウェルの500マイクロリットルのベシクルフリー培地に適量の抗生物質を加えます。次に、細菌の増殖を防ぐために、小胞を含まない培地を含まないウェルにリファンピシンを含むPBSを追加します。
解剖顕微鏡下で両面カーペットテープでスライドガラスの上にダニを置きます。解剖する前に、リファンピシンを含むPBSをダニに加え、4ミリメートルのバンナハサミを使用して、各女性の側面に約1ミリメートルの切開を行います。次に、ダニの背側と唾液腺を取り除き、24ウェル組織培養処理プレートの単一のウェルに加えた500マイクロリットルの小胞を含まない培地に20〜40個のダニの唾液腺を入れます。
唾液腺サンプルを摂氏32度で24時間インキュベートして、細胞外小胞の分泌を可能にします。インキュベーションの最後に、唾液腺を含むすべての培地を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで入れ、摂氏4度で300倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
後で唾液腺を含むペレットをRNAに再懸濁し、使用するまで摂氏マイナス80度で無期限に保管します。次に、上清を摂氏4度で2, 000倍Gで10分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。次に、摂氏4度で30分間10, 000倍Gで遠心分離し、アポトーシス小体とより大きな細胞外小胞を除去し、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
次に、10ミリリットルのシリンジに1マイクロメートルのナイロンシリンジフィルターを組み立て、超遠心チューブに保管します。次にサンプルを追加し、シリンジに10ミリリットルのPBSを充填します。上清をフィルターを通してチューブに通します。
チューブをろ過してバランスをとった後、70 Tiローターに入れ、摂氏4度で18時間、100、000倍Gでチューブを超遠心分離します。濃縮された細胞外小胞は、超遠心分離後にペレットを形成する。ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットをPBSに再懸濁します。
500マイクロリットルの細胞外小胞を300 K遠心フィルターにピペットで入れ、周囲温度で8, 000倍Gで10分間遠心分離し、すべての細胞外小胞がろ過されるまでこの手順を繰り返します。最後に、400マイクロリットルの滅菌PBSをカラムに加え、十分に混合して、膜に付着した細胞外小胞を除去します。次に、サンプルを1.5ミリリットルのDNAアーゼRNAseフリーチューブに入れます。
細胞外小胞の濃度と大きさは、雌、雄、ニンフの生物学的複製の間のダニの性別とライフステージによって異なりました。全ての組み合わせた生物学的複製について、同様の結果が観察された。唾液腺から単離された低分子RNAの解析は、リボソームRNAおよびマイクロRNAに対応するバンドを示した。
しかし、唾液腺から分離された小胞にはリボソームRNAは存在せず、細胞外小胞から精製されたマイクロRNAサンプルはより多くの分解を示しました。濃縮後、EVから精製されたマイクロRNAサンプルは、最小限の分解とcDNAライブラリ合成に十分なマイクロRNA濃度を示しました。cDNAライブラリ調製後に約150塩基対の予想されるバンドサイズが得られたことは、低分子RNA cDNAライブラリを意味する。
ベシクルフリーの準備中は、外部ベシクルの汚染を防ぐための手順に従ってください。ウェルプレートの準備中は、ダニの微生物叢からの細菌汚染を防ぐために抗生物質を必ず追加してください。このプロトコルを使用して抽出されたマイクロRNAは、マイクロRNA経路の標的の予測、阻害、模倣実験などのマイクロRNAの役割を検証するためのプロファイリングおよび機能実験に使用できます。
