この研究は、ラットの肺内動脈および血管平滑筋細胞の単離について説明しています。肺内動脈の血管反応を調べるために臓器浴技術を使用するなど、いくつかの実験プロトコルが採用されました。肺内動脈と血管平滑筋細胞は、血管生理学と病態生理学を研究するための優れたモデルです。
この技術の適応は、あらゆる薬物、抽出物または植物化学物質の血管応答を評価することができる。孤立した肺内動脈リングを臓器浴に取り付けることで、孤立した肺内動脈を使用して、肺高血圧症を含むさまざまな疾患の調節における薬物の役割を評価できます。実験プロトコルは技術的に実現可能ですが、重要なステップは複雑で成功に不可欠であるため、視覚的なデモンストレーションを行うことで、理解とフォローが容易になります。
手順を実演するのは、ナレースワン大学医学部生理学部生理学教室心臓血管研究ユニット研究室の生理学修士課程の学生であるキティウート・トゥーオンです。まず、肺の片葉を11センチのハサミでスライスし、内側または肺の根元を上に向けて9センチのペトリ皿に置きます。静脈、気管支、動脈の上から下への配置を観察して識別します。
ハサミで気管支を縦方向に切り開きます。次に、11センチの鉗子を使用して気管支の先端をつかみます。気管支と静脈を静かに解剖して肺から取り除きます。
鉗子を使用して肺内動脈の先端をつかみ、ハサミで肺組織から慎重に解剖します。臓器浴アセンブリが設定されるまで、孤立した肺内動脈を冷たいクレブス溶液に保管してください。肺内動脈を隔離した後、肺内動脈の主枝を11センチメートルのハサミで縦方向に切り開き、2ミリメートルのストリップに切断します。
肺内動脈ストリップをDMに浸し、次に、1ミリリットルのパパインあたり1ミリグラム、0.04%BSA、および0.4ミリモルDTTを含むDMで、摂氏4度でストリップを1時間インキュベートします。その後、摂氏37度で15分間インキュベートします。DMにコラゲナーゼタイプIAを1ミリリットルあたり1ミリグラム加え、再び摂氏37度で5分間インキュベートします。
組織を新鮮なDMに移し、ガラス製のパスツールピペットを使用して穏やかに粉砕して分散させます。単離された血管平滑筋細胞が顕微鏡下で入浴溶液中に見えるようになるまで、粉砕を続けます。前に示したように肺内動脈を分離し、肺内動脈の主枝を長さ約2ミリメートルのリングに切断します。
肺内動脈リングを臓器浴室に、直径40マイクロメートルのステンレス線2本に通して貼り付けます。肺内動脈リングに取り付けられたステンレス鋼線を、データ収集デバイスに接続された等尺性力トランスデューサーと、データの記録と分析に適した生理学的ソフトウェアがインストールされたコンピューターシステムに取り付けます。次に、肺内動脈リングの張力を1グラムに静かに上げます。
血管セグメントを1グラムの静止張力で約45分間平衡化させます。平衡期間中は、クレブス溶液が15分ごとに定期的に交換されることを確認してください。平衡化後、血管の血管収縮を高細胞外カリウム溶液に測定することにより、血管の生存率をテストします。
PEと事前に契約されたリングにおけるアセチルコリンに対する緩和応答を計算することにより、内皮の有無を評価します。血管の内側を細いワイヤーで優しくこすって内皮を機械的に取り除き、露出を誘発します。次に、試験実験の開始前に30分間動脈リングを平衡化します。PEで肺内動脈リングを事前に収縮させることにより、植物抽出物の弛緩効果を調べます。次に、植物抽出物1ミリリットルあたり0.1〜1000マイクログラムを内皮の無傷のリングと内皮の露出したリングに累積的に注意深く追加して、血管弛緩を誘発し、濃度依存の応答曲線を獲得します。
溶媒として使用される有効なDMSOも、ネガティブコントロールとして機能するように同様に評価されることを確認する。テキスト原稿に記載されているように、植物抽出物の血管弛緩作用機序を評価します。次にPEへの収縮が安定した後、植物抽出物の累積濃度を加える。
植物抽出物の効果を、阻害剤なしの肺内動脈リングの応答と比較した阻害剤の存在下での肺内動脈輪の弛緩率として提示し、濃度応答曲線を作成します。内皮インタクトな肺内動脈において、植物抽出物は血管弛緩の濃度依存的応答を誘発した。内皮の除菌は、EC50の2.2倍の増加に反映されるように、植物抽出物によって誘発される血管弛緩を大幅に減少させ、eNOSおよびEDHFの阻害は、植物抽出物に対する血管弛緩応答を明らかに減少させた。
これにより、濃度応答曲線が右にシフトし、E max値を変更することなくEC50が増加しました。それどころか、インドメタシンは植物抽出物に対する血管弛緩反応に影響を示さなかった。内皮露出肺内動脈リングでは、カルシウム活性化カリウムチャネル遮断薬が植物抽出物に対する血管弛緩反応を低下させました。.
一方、電位依存性またはATP感受性カリウムチャネルの遮断薬は偏差を示さなかった。植物抽出物とのプレインキュベーションは、塩化カルシウム誘発収縮を抑制した。内皮露出した肺内動脈リングは、カルシウムフリーのクレブス溶液とPEでプレインキュベートされ、一過性の収縮を引き起こしました。
ビヒクルと比較して、植物抽出物はPEによって誘発される収縮を有意に減少させた。手順の間、早い段階で静脈、気管支、および動脈を明確に識別する必要があります。動脈を切断または損傷すると、動脈の長さが短くなり、血管反応に影響を与えます。この技術は、肺動脈性肺高血圧症などの肺血管疾患の治療のプロトタイプとして役立つ可能性のある化合物を調査するために適用できます。
