膨張顕微鏡法の大きな制限の1つは、重合および消化後の蛍光が遅くなることです。ラベル保持拡大顕微鏡は、LR-ExMと呼び、重合と消化のためにある三官能アンカーを使用します。トライファンクションアンカーを使用した後、膨張ステップの後に蛍光を導入します。
そのため、高解像度でありながら良好な信号対雑音比を維持します。ラベル保持拡張顕微鏡は、以前に導入された他の拡張顕微鏡、および蛍光顕微鏡と組み合わせることができます。汎用性の高い方法で非常に堅牢です。
また、高レギュレーションイメージングでは、信号を強化することが非常に重要です。まず、摂氏37度と5%の二酸化炭素で完全な培地を含む16ウェルの取り外し可能なチャンバー付きカバーガラス上で細胞を培養します。細胞数が約40, 000に達したら、100マイクロリットルの3.2%PFAをPEMバッファーに室温で10分間固定します。
次いで、100マイクロリットルの透過処理バッファーを用いて細胞を室温で15分間透過処理する。細胞ブロッキングバッファーで希釈したストレプトアビジン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートした後、200マイクロリットルのセルブロッキングバッファーで短時間すすぎます。次に、細胞ブロッキングバッファーで希釈した100マイクロリットルのビオチン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。
その後、ラット抗アルファチューブリン抗体とウサギ抗クラスリン重鎖抗体を含む100マイクロリットルの一次抗体溶液で、摂氏4度で16時間または室温で1時間細胞をインキュベートします。次に、三官能アンカー、ロバ抗ウサギ掘り出し物MA、およびロバ抗ラットビオチンMAを含む100マイクロリットルの二次抗体溶液で細胞を室温で1時間インキュベートします。タンパク質をヒドロゲルに固定するために、100マイクロリットルの0.25%グルタルアルデヒドで室温で15分間細胞をインキュベートします。
かみそりの刃または任意の取り外しツールを使用して16ウェルプレートの上部構造を取り外し、下部カバーガラスを保持します。カバーガラスをペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。モノマー溶液を45マイクロリットルずつ各ウェルに加え、細胞をコンディショニングします。
氷上で5分間インキュベートします。ゲル化溶液を作るには、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを準備します。モノマー、二重蒸留水、および10%T薬を混合します。
硫酸塩あたりアンモニウムをまだ添加しないでください。その間、ゲル化溶液チューブを氷の上に置いておきます。ゲル化溶液に10%過硫酸アンモニウムを加える。
ゲル化溶液チューブを氷上に保存しながら、直ちに40マイクロリットルのゲル化溶液を各ウェルにピペットで入れます。ウェルプレートを氷の上にさらに3分間置きます。摂氏37度のインキュベーション中にゲルの湿度を保つために、ペトリ皿を蓋で覆い、ペトリ皿に数滴の水を入れた。
サンプルを光から保護しながら、カバーガラスと10センチのペトリ皿を摂氏37度のインキュベーターに1.5時間移動してゲル化させます。ゲル化後、カバーガラスを切断して各ゲルを分離する。ゲルを6つのウェルプレートに移します。
各ウェルに2ミリリットルの消化バッファーを追加します。サンプルを室温で一晩放置するか、摂氏37度で4時間放置します。次いで、洗浄工程を毎回20〜30分間4回繰り返しながら、最終ゲル体積よりも少なくとも10倍過剰量の水でゲルを洗浄し、ゲルは各次元で約4倍膨張する。
サンプルを暗所に保ちながら、2〜5マイクロモルのストレプトアビジン色素および/または抗ジゴキシゲニン色素を含む2ミリリットル容量のストレプトアビジンジゴキシゲニン染色バッファーでゲルを室温で24時間インキュベートします。次に、ゲルを過剰な水で2〜4回洗浄して膨張させます。各洗浄には約30分から1時間かかります。
蛍光顕微鏡下で細胞を簡単に可視化するには、3回目の洗浄時にDAPIで細胞を染色します。DAPIストックを洗浄水で1〜5, 000の妄想に希釈します。ゲルをDAPI溶液で30分から1時間インキュベートします。
その後、3ミリリットルの水でさらに2回洗います。6ウェルガラス底部イメージングチャンバーに3ミリリットルの0.01%ポリリジンをコーティングして、ゲルサンプルを固定化します。次に、ゲルサンプルをコード化されたイメージングチャンバーに移し、任意の蛍光スコープでサンプルをイメージングします。
標識保持拡大顕微鏡は、タンパク質保持拡大顕微鏡またはビオチン拡大顕微鏡サンプルと比較して強化された蛍光標識を示します。標識保持拡大顕微鏡は、タンパク質保持拡大顕微鏡と比較して約6倍高い蛍光シグナルを示します。LR-ExMは、クラスリンコーティングされたピットなどの小さな構造を、サブデフラクション限界分解能で効果的にキャプチャできます。
微小管およびクラスリンコーティングピットは、機能性アンカー、NHS MAディグ、およびNHS MAビオチンを用いた共免疫染色であった。同様に、クラスリンでコーティングされたピットとミトコンドリアは、BG MAビオチンやBC MAディグなどの三官能アンカーを用いた酵素タンパク質タグアプローチを用いて標識されました。さらに、免疫染色ベースのアプローチと酵素タンパク質タグアプローチを組み合わせて、ラミンA/Cとヌクレオポア複合体の構造を示します。
標識保持拡大顕微鏡は、シナプス前マーカーであるファゴットとシナプス後マーカーであるホーマー1を共免疫染色することにより、マウス脳組織に対して実施しました。2つのラベルは透明で十分に分離されており、高解像度とラベリング効率をサポートしています。労働保持拡張顕微鏡は、汎用性が高く堅牢な方法であり、以前に導入された他の拡張顕微鏡と組み合わせることができます。
高解像度イメージングのためには、分子スケール構造をよりよく捉えるために良好な標識効率を達成することが重要である。労働保持拡大顕微鏡は、シグナルを増強するための効果的で堅牢な方法です。
