この映画の目標は、卵巣機能不全患者に対する新しいアプローチの手順を実証することです。卵巣機能は、加齢の間に徐々に低下し、核型異常、自己免疫疾患、化学療法および放射線療法、卵巣手術を含むいくつかの病態生理学的状態。低卵巣予備軍を有する中年女性のほとんどは、成熟した卵母細胞を生み出すために卵巣刺激に対する卵巣反応が悪い。
さらに、多くの角胞を有する若年患者は、卵巣刺激に対する卵巣応答が悪いことも示した。不妊治療の保存は、将来の妊娠のための潜在的なOCSを保存するために重要です。不妊治療の保存のために、卵母細胞凍結保存が確立された。
しかし、これらの貧しい卵巣応答患者は、適切な卵巣刺激の後でさえ非常に限られた数の卵母細胞を取り出す可能性があり、1人の赤ちゃんを保証するのに十分な数の卵母細胞を確保するために高価な処置を繰り返す必要がある。これらの問題を解決するために、我々は最近、卵巣卵胞の初期段階を刺激して前の卵胞段階に発達することを可能にするin vitro活性化、IVA手順を開発した。元のIVA手順は、卵巣皮質の断片化によって原始、原発、二次卵胞の成長を促進し、カバのシグナル伝達破壊につながる。
その後、Aktシグナル伝達刺激器で2日間培養します。この手順は、少ない残留卵胞を有するPOI患者に適している。しかし、この手順は、複数の二次卵胞を有する患者に対する過剰な治療である。
いくつかの残留二次卵胞を有する患者のために、我々は薬物フリーIVAと呼ばれる方法を確立し、カバのシグナル伝達経路を破壊するだけで二次卵胞の成長を促進する可能性を既にテストした。我々はまた、薬物フリーIVAによる出産のいくつかの成功したケースを持っています。我々はすでに薬物フリーIVAの外科的処置および卵巣刺激に続くプロトコルを発表した。
本ビデオでは、薬物を含まないIVAに必要なラボメソッドの詳細を紹介します。ボローニャ基準に基づいて、薬物を含まないIVAの患者を募集しました。患者は複数の二次卵胞を有することができる。
最初、皮質の一部は腹腔鏡検査によって片方または両方の卵巣から取り除かれた。POR患者は、中型卵巣を有していた患者である。ほとんどの患者では、片方または両側の卵巣から皮質組織の一部のみを抽出した。
抽出された重要組織は、HEPESバッファーを含む培養培地を含む培養皿に直ちに移され、カバのシグナル伝達破壊のためにこの小さな組織を小さな立方体に解剖した。手順の詳細は、このビデオで示されます。カバのシグナル伝達経路は、最適な臓器サイズを維持するために不可欠です。
この経路は、いくつかの負の成長調節因子で構成されています。カバのシグナル伝達が中断されると、キナーゼカスケードで作用する負の成長調節因子の1つであるYAPのリン酸化レベルが低下し、YAPの核レベルが増加する。YAPはTEAD転写因子と協調して作用し、下流のCCN成長因子を増加させる。
一方、球状作用のアクチン重合は、G-アクチン、糸状体に対して、F-アクチン、細胞形状維持および移動にとって重要である。F-アクチン形成の以前に報告された誘導は、カバのシグナル伝達を破壊し、ヒトHeLa細胞の過剰増殖を誘発する。我々は以前に、卵巣断片化がF-アクチン形成を増加させ、YAPのリン酸化レベルの低下をもたらすと報告した。
CCN成長因子の発現増加につながる。切断後、これらのキューブは残りの卵巣に移植される。この手順は、残留二次卵胞の成長を促進し、成熟卵母細胞の増加につながることができます。
薬物を含まないIVAは、4つのステップで構成されています。我々はすでに薬物フリーIVAの外科的処置を発表した。卵巣皮質抽出と自動移植のためのその文献を参照してください。
ここでは、薬物を含まないIVAに必要な実験室法の詳細な手順を示します。ステップ1では、卵巣皮質の断片化がどのように行われるかを示す。ステップ2では、移植のために卵巣皮質キューブを装置にロードする方法を示し、ここでは卵巣皮質の断片化を示します。
この研究は、私たちの研究所の倫理委員会によって承認されました, そして、すべての手順は、世界医師会の倫理規定に従って行われました.卵巣皮質の断片化。このステップに必要な次のツール:皿、滅菌ガーゼ、細かいはさみ、細かい鉗子、メス。
我々は通常、このタイプの皿および滅菌ガーゼを使用するが、プラスチックペトリ皿、ガラス皿、エトセトラのような他の製品もこの手順に適している可能性があり、滅菌ガーゼの任意のタイプも適している。しかし、私たちは強く鉗子とメスのこの形状の使用をお勧めします。また、組織を含む食器の温度を維持するためにホットプレートを使用無菌ドレープの下に置きます。
皮質組織は、mHTFを含む皿にすぐに移される。患者のデータと関連付けるための患者の名前で写真を撮ります。組織の大きさ、厚さ、状態を記録します。
残りの髄質組織を除去する。組織の断片化の前に、髄質組織を取り除く。皮質を無菌ガーゼに置きます。
ビデオに示すように、ガーゼは培地で湿潤します。この手順の間に、皮質の表面が乾燥する前に使い捨てピペットで培地を適用する。厚さが1~2ミリメートルになるまで、マイクロハサミで残留組織を取り除きます。
POR患者では、二次卵胞は皮質表面から1ミリメートルよりも深く位置しているので、組織の厚さは1ミリメートル未満にしないでください。組織学的解析のために各組織の皮質の片側を1つずつ5ミリメートルずつ測定するストリップに切り取り、残留卵胞の存在を決定します。このストリップを培養培地で1.5ミリリットルチューブに入れ、固定するまで摂氏4度に保ちます。
卵巣皮質キューブの調製.髄質組織の除去後、卵巣皮質はカバのシグナル伝達破壊のために断片化される。最初は、メスを使って皮質を1つずつ10ミリメートルのストリップに切ります。
その後、これらのストリップを1ミリメートル立方体の小さな立方体にカットします。培地では、組織は滑りやすく、切断が困難です。簡単に切断するには、それを引っ張るのではなく、メスを押し下げてストリップをカットします。
切断後、立方体の数を数え、自動移植を準備します。培地中の浸透圧の変化を避けるために、組織の自動移植の前に適度に培地を加える。卵巣のオートグラフトのために、カニューレ形の装置の使用は容易な積み込みを可能にする。
この手順には、2 つの手順が含まれます。以前は、卵巣断片を腹腔鏡下で鉗子を用いて1つ移植した。しかし、手術が完了するまでに約3〜4時間かかりました。
この手順では、内側のシリンジと外気筒でできた角形の装置を使用します。シンプルな形状で軽量です。また、この装置の先端は丸い形状である。
移植部位の損傷を避ける鋭い点はありません。このタイプのデバイスを使用すると、一度に20〜30キューブを移植部位に持ち込めます。これは、効率的な移植と手術時間の短縮につながります.
卵巣皮質断片をロードする。IVAカニューレの調製。IVAカニューレを準備し、mHTFでこの装置を洗います。
吸気と吐出培地を数回繰り返します。約100マイクロリットルの培地を吸引してカヌラの先端を充填する。これは、組織フラグメントのロード中に立方体が引き出されるのを防ぐためです。
皮質キューブをロードしています。細かい鉗子で立方体を選び、カヌラの先端に入れます。オートグラフトキューブの数は、移植部位の大きさに依存します。
目標の数に達するまで、キューブを 1 つずつ読み込む。キューブをロードした後、外科医にカニューレを慎重に渡します。移植部位が準備ができていない場合、卵巣キューブを含むカヌラの部分は、立方体の温度の低下を避けるために指で保持される。
我々はすでに薬物フリーIVAの臨床結果を報告している。臨床結果に関する論文をご参照ください。この実験室の議定書は1人の患者のために30から50分を要求した。
平均時間は、卵巣皮質の断片化のための10〜20分、IVAカニューレにこれらの断片をロードするための20〜30分です。これは組織の大きさに依存しますが、ほぼすべての患者はこの平均時間で終了することができます。結論。薬物を含まないIVAは、卵巣予備軍の減少を伴うPOR患者に対する不妊治療の新しいアプローチである。
これらの実験室の議定書は、手術に要する時間と移植中の断片の損失の両方の短縮をもたらす。薬物を含まないIVAの実験室技術は、移植せずに成熟した卵母細胞を得るために卵巣組織培養の将来の適用の基礎となり得る。
