このプロトコルにより、研究者はC-エルガンがアセチルコリン受容体アゴニストレバミゾールにどのように反応するかを観察することができます。レバミゾールの感受性の変化は、神経筋接合部または筋肉機能でのシグナル伝達の欠陥を示唆する可能性があります。.主な利点は、レバミゾール溶液中のC-エルガンの激しい水泳により、研究者がわずか1時間で数百のワームの時間依存性麻痺を定量化できることです。
5分ごとに各ウェルのワームの数を数えるのは圧倒される可能性があります。アッセイするウェルの数、または時点は、必要に応じて調整することができる。開始するには、攪拌子付きのフラスコに3グラムの塩化ナトリウム、2.5グラムのペップトーン、および17グラムの寒天を1リットルの脱イオン水と組み合わせることにより、線虫増殖培地を調製します。
オートクレーブ後、70°Cに設定したホットプレートに培地を置き、適度な速度で1時間攪拌します。沈殿を防ぐために、1ミリリットルのコレステロールあたり5ミリグラムを滴下します。1ミリリットルの1モルの塩化カルシウム、1ミリリットルの1モルの硫酸マグネシウム、および25ミリリットルの1モルのpH6.0リン酸カリウム緩衝液を培地に供給する。
2ミリリットルの線虫増殖培地を滅菌血清学的ピペットを用いて24ウェルプレートの各ウェルに移す。プレートをベンチトップで2日間乾燥させてから、バクテリアと一緒に座らせました。単一のop 50コロニーをBブロスに入れ、培養液を摂氏37度で一晩振とうします。
滅菌ピペットを使用して、30マイクロリットルのOP50懸濁液を各ウェルの中央にある寒天に滴下します。プレートを着席後少なくとも2日間室温で放置して、細菌の芝生を形成させます。野生型unc-63 Lev10とunc-49 C-elganを6センチメートルのプレートで成体まで成長させ、1株あたり少なくとも8枚のプレートを準備します。
同期の日にフードの下で漂白液を準備します。10ミリリットルの漂白剤、2.5ミリリットルの水酸化ナトリウム、および37.5ミリリットルの脱イオン水を50ミリリットルのクロニクルチューブに混ぜます。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、M9バッファーで少なくとも4枚のプレートから妊娠した成虫を洗浄し、それらを15ミリリットルのクロニクルチューブに移します。
その716Gを室温で1分間回転させた後、トランスファーピペットを用いて上清を除去します。10ミリリットルの漂白液を加えます。ほとんどのワームの死骸が溶解するまで、チューブを4分間静かに振ってください。
716 Gで1分間回転します。漂白剤溶液を一気に注ぎます。この時点でチューブが振られない限り、卵は15ミリリットルのM9バッファーでチューブの側面にくっつき、反転します。
716 Gで1分間回転し、M9バッファーを1回の滑らかな動きで注ぎます。この洗浄を緩衝液で3回繰り返す。最後の洗浄後、10ミリリットルの新鮮なM9を加え、摂氏15度で一晩ローテーターに置き、飢えた最初の幼虫期の動物の同期集団を分離します。
24ウェルプレートに印刷し、ランダム化された場所に菌株を割り当てます。漂白剤調製の約24時間後、孵化した飢えたL1ワームを716Gで室温で1分間スピンダウンします。プラスチック製のトランスファーピペットで約9ミリリットルのM9バッファーを取り除き、残りのM9バッファーに飢えた最初の幼虫期のワームを静かに混合します。
直ちに3マイクロリットルのワームとM9バッファーを顕微鏡スライドにピペットで移し、L1の数を測定します。望ましい数は、3マイクロリットルで20〜30 L1です。事前に作成されたプレートマップに従って、3マイクロリットルのL1を各ウェルにピペットで入れ、ワームを摂氏20度で3日間成虫に成長させます。
各ウェル内を移動するワームの数を5分ごとに1時間記録するために使用される空白のデータシートを印刷します。24ウェルプレートのワームを確認します。マーカーを使用して、汚染されている、飢えている、またはワームが多すぎるウェルの上にプレートの蓋にXを付けます。
50ミリリットルのM9に200マイクロリットルの100ミリモルのレバミゾールストックを加えて、0.4ミリモルのレバミゾール溶液を作ります。タイマーを開始し、次にトランスファーピペットを使用して、動物が自由に泳ぐように、最初の2つのウェルに1ミリリットルの0.4ミリモルのレバミゾールを追加します。隣接するウェルにレバミゾールを追加し続け、アッセイするウェルの数に応じて時間をずらします。5分後に、最初のウェルから始めて、各ウェル内の移動するワームの数のみを手動でカウントし始め、その数をデータシートに記録します。
各ウェル内の移動するワームの数を5分ごとに1時間カウントし続けます。アッセイの終了時または時間が許せば、各ウェル内のワームの総数を記録します。プレートを取得し、各ウェルに対応する菌株をマッピングして記録します。
各ウェルのワームの総数から始めて、遺伝子型別に整理したデータをスプレッドシートに入力します。ウェルからのデータを組み合わせて、各時点で移動するワームの数を決定します。これを使用して、各時点で麻痺する数を計算します。
左側の列が時間を示し、後続の列に各ひずみのデータが含まれるようにデータテーブルを作成します。最初の 5 分以内に麻痺した動物ごとに、行を作成し、5 分間 1 つ入力します。各時点についてこれを繰り返します。
アッセイの終わりまでに麻痺しないすべての動物について、60分間ゼロを入力します。これらのデータを使用して、ここで使用する特定の統計ソフトウェアで生存曲線を作成し、母集団の時間依存性麻痺を視覚的に表示します。アッセイされたすべての菌株のデータは、必要に応じてスペースを残して同じデータテーブルに入力する必要があります。
レバミゾールアセチルコリン受容体のサブユニット、およびシナプス後レバミゾール感受性アセチルコリン受容体のクラスタリングに必要な遺伝子の変異は、それぞれunc-63およびLev-10変異体で観察されるように、レバミゾール誘発麻痺に対する耐性を引き起こす。GABA依存性イオンチャネルunc-49の喪失は、コリン作動性およびGABA作動性シグナル伝達の適切なバランスの崩壊によるレバミゾール過敏症を引き起こした。24ウェルプレートの適切な準備が不可欠です。
L1を発見する前に細菌の芝生が乾燥していない場合、レバミゾール溶液はアッセイ中に濁り、観察を妨げる可能性があります。24ウェルプレートを改変することにより、このプロトコルはRNAiノックダウン動物を用いて行うことができる。これにより、研究者は突然変異体が利用できないC-elganの遺伝子を研究することができます。
