Bu protokol, araştırmacıların C-elganların asetilkolin reseptörü agonisti Levamisole'ye nasıl tepki verdiğini gözlemlemelerini sağlar. Değişmiş Levamisol duyarlılığı, nöromüsküler kavşaklarında veya kas fonksiyonlarında sinyalleşmede kusurlar olduğunu düşündürebilir. En büyük avantajı, C-elganların Levamisole çözeltisinde kuvvetli bir şekilde yüzmesinin, araştırmacıların yüzlerce solucanın zamana bağlı felcini sadece bir saat içinde ölçmelerine izin vermesidir.
Her beş dakikada bir her kuyucuktaki solucan sayısını saymak çok zor olabilir. Analiz edilen kuyu sayısı veya gerekirse zaman noktaları ayarlanabilir. Üç gram sodyum klorür, 2.5 gram pep tonu ve 17 gram agar'ı bir karıştırma çubuğuna sahip bir şişede bir litre deiyonize su ile birleştirerek nematod büyüme ortamı hazırlamaya başlamak için.
Otoklavlamadan sonra, ortamı 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcak plakaya koyun ve bir saat boyunca ılımlı bir hızda karıştırın. Yağışı önlemek için mililitre kolesterol damlası başına bir mililitre beş miligram ekleyin. Bir mililitre bir molar kalsiyum klorür, bir mililitre bir molar magnezyum sülfat ve 25 mililitre bir molar pH 6.0 potasyum fosfat tamponu ortama.
İki mililitre nematod büyüme ortamını, steril bir serolojik pipet ile 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Bakterilerle oturmadan önce plakaların tezgah üstünde iki gün kurumasına izin verildi. B suyuna tek bir op 50 kolonisi seçin ve kültürü bir gecede 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Steril bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğun ortasındaki agarın üzerine 30 mikrolitre OP50 süspansiyon bırakın. Bakteriyel bir çimin oluşmasına izin vermek için plakaların oturduktan sonra en az iki gün oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Yabani tip unc-63 Lev10 ve unc-49 C-elgan'ı altı santimetrelik plakalarda yetişkinliğe kadar yetiştirin ve suş başına en az sekiz plaka hazırlayın.
Senkronizasyon gününde kaputun altında ağartma çözeltisi hazırlayın. 50 mililitrelik kronik bir tüpte 10 mililitre ağartıcı, 2.5 mililitre sodyum hidroksit ve 37.5 mililitre deiyonize su karıştırın. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, gravid yetişkin solucanları M9 tamponu ile en az dört plakadan yıkayın ve bunları 15 mililitrelik bir kronik tüpe aktarın.
Bu 716 G'yi oda sıcaklığında bir dakika döndürün ve ardından bir transfer pipeti kullanarak süper natantı çıkarın. 10 mililitre beyazlatma çözeltisi ekleyin. Tüpü çoğu kişiye kadar dört dakika boyunca yavaşça sallayın, ancak solucan karkaslarının tümü çözünmemiştir.
Bir dakika boyunca 716 G'de döndürün. Ağartıcı çözeltisini tek bir hareketle dökün. Tüp bu noktada çalkalanmadığı sürece, yumurtalar 15 mililitre M9 tamponunda tüpün yanına yapışacak ve ters çevrilecektir.
Bir dakika boyunca 716 G'de döndürün ve M9 tamponunu tek bir yumuşak hareketle dökün. Bu yıkamayı tampon çözeltisi ile üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, 10 mililitre taze M9 ekleyin ve aç ilk larva aşaması hayvanlarının senkronize bir popülasyonunu izole etmek için gece boyunca 15 santigrat derecede bir rotatöre yerleştirin.
24 kuyu plakasına yazdırın ve rastgele yerlere suşlar atayın. Ağartıcı hazırlığından yaklaşık 24 saat sonra, yumurtadan çıkmış aç L1 solucanlarını oda sıcaklığında bir dakika boyunca 716 G'de döndürün. Yaklaşık dokuz mililitre M9 tamponunu plastik bir transfer pipeti ile çıkarın ve ardından açlıktan ölen ilk larva aşaması solucanlarını kalan M9 tamponunda yavaşça karıştırın.
Hemen üç mikrolitre solucan ve M9 tamponunu mikroskop sürgüsüne pipetleyin ve L1'lerin sayısını belirleyin. İstenilen sayı üç mikrolitrede 20 ila 30 L1'dir. Önceden hazırlanmış plaka haritasına göre her bir kuyucuğa üç mikrolitre L1'in pipetin, solucanların 20 santigrat derecede üç gün boyunca yetişkinliğe kadar büyümesine izin verin.
Bir saat boyunca her beş dakikada bir kuyucukta hareket eden solucanların sayısını kaydetmek için kullanılacak boş veri sayfasını yazdırın. 24 kuyu plakasındaki solucanları kontrol edin. Bir işaretleyici kullanarak, kontaminasyonu olan, aç kalmış veya çok fazla solucanı olan kuyucukların üzerinde plaka kapağında bir X yapın, bu da sayımı zorlaştıracaktır.
50 mililitre M9'a 200 mikrolitre 100 milimolar levamisol stoğu ekleyerek 0.4 milimolar Levamisol çözeltisi yapın. Bir zamanlayıcı başlatın ve ardından bir transfer pipeti kullanarak ilk iki kuyucuğa bir mililitre 0.4 milimolar levamisol ekleyin, böylece hayvanlar serbestçe yüzüyor. Bitişik kuyulara Levamisole eklemeye devam edin, zamanı test edilecek kuyu sayısına göre şaşırtın. Beş dakika sonra, ilk kuyudan başlayarak her bir kuyucuktaki yalnızca hareketli solucanların sayısını el ile saymaya başlayın ve bu sayıyı veri sayfasına kaydedin.
Bir saat boyunca her beş dakikada bir her kuyucuktaki hareketli solucanların sayısını saymaya devam edin. Tahlilin sonunda veya zaman izin verdiğinde, her kuyucuktaki toplam solucan sayısını kaydedin. Plakayı alın, haritalayın ve her bir kuyucuğa hangi gerinimin karşılık geldiğini kaydedin.
Verileri her bir kuyucuktaki toplam solucan sayısından başlayarak ve genotipe göre düzenleyerek bir elektronik tabloya girin. Kuyulardan gelen verileri birleştirerek, her zaman noktasında hareket eden solucanların sayısını belirleyin. Her zaman noktasında felç olan sayıyı hesaplamak için bunu kullanın.
Sol sütunda zamanı gösterecek ve sonraki sütunlar her gerinim için verileri içerecek şekilde bir veri tablosu oluşturun. İlk beş dakika içinde felç olan her hayvan için bir satır oluşturun ve beş dakika boyunca bir satır girin. Bunu her zaman noktası için tekrarlayın.
Tahlilin sonunda felç olmayan tüm hayvanlar için, 60 dakika boyunca sıfır girin. Bu verileri, popülasyonun zamana bağlı felcini görsel olarak görüntülemek için burada kullanılan belirli istatistiksel yazılımda bir hayatta kalma eğrisi oluşturmak için kullanın. Analiz edilen tüm suşlar için veriler, gerektiğinde boşluklar bırakılarak aynı veri tablosuna girilmelidir.
Levamisol asetilkolin reseptörünün alt birimlerindeki ve ayrıca postsinaptik Levamisol duyarlı asetilkolin reseptörlerinin kümelenmesi için gerekli genlerdeki mutasyonlar, sırasıyla unc-63 ve Lev-10 mutantlarında gözlendiği gibi Levamisol kaynaklı felce direnç gösterir. GABA kapılı iyon kanalı unc-49'un kaybı, kolinerjik ve GABAerjik sinyallemenin uygun dengesinin bozulması nedeniyle Levamizol aşırı duyarlılığına neden oldu. 24 kuyu plakasının uygun şekilde hazırlanması esastır.
L1'leri tespit etmeden önce bakteriyel çimler kuru değilse, Levamisol çözeltisi tahlil sırasında bulanıklaşabilir ve bu da gözlemi engeller. 24 kuyu plakasını değiştirerek, bu protokol RNAi devrilmiş hayvanlarla gerçekleştirilebilir. Bu, araştırmacıların mutantların bulunmadığı C-elgan'ın genlerini incelemelerine izin verir.
