Questo protocollo consente ai ricercatori di osservare come i C-elgans rispondono all'agonista del recettore dell'acetilcolina Levamisole. L'alterata sensibilità al levamisolo può suggerire difetti nella segnalazione alla loro giunzione neuromuscolare o funzione muscolare. Un grande vantaggio è che il vigoroso nuoto di C-elgans nella soluzione di levamisolo consente ai ricercatori di quantificare la paralisi dipendente dal tempo di centinaia di vermi in una sola ora.
Contare il numero di vermi in ogni pozzetto ogni cinque minuti può essere travolgente. Il numero di pozzi analizzati o i punti temporali possono essere regolati se necessario. Per iniziare preparare i terreni di crescita dei nematodi combinando tre grammi di cloruro di sodio, 2,5 grammi di pep tone e 17 grammi di agar con un litro di acqua deionizzata in un pallone con un mescolatore.
Dopo l'autoclave, mettere il supporto su una piastra calda impostata a 70 gradi Celsius e mescolare a una velocità moderata per un'ora. Aggiungere un millilitro di cinque milligrammi per millilitro di colesterolo goccia a goccia per prevenire le precipitazioni. Un millilitro di un cloruro di calcio molare, un millilitro di un solfato di magnesio molare e 25 millilitri di un tampone molare pH 6,0 fosfato di potassio al supporto.
Trasferire due millilitri di terreno di crescita dei nematodi in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con una pipetta sierologica sterile. Lasciato asciugare i piatti sul piano del banco per due giorni prima di sedersi con batteri. Scegli una singola colonia op 50 nel brodo B e imposta la cultura a 37 gradi Celsius durante la notte.
Utilizzando una pipetta sterile, far cadere 30 microlitri di sospensione OP50 sull'agar al centro di ciascun pozzetto. Lasciare riposare i piatti a temperatura ambiente per almeno due giorni dopo la seduta per consentire la formazione di un prato batterico. Coltiva selvatici tipo unc-63 Lev10 e unc-49 C-elgan fino all'età adulta su piastre di sei centimetri, preparando almeno otto piastre per ceppo.
Preparare la soluzione sbiancante sotto il cofano il giorno della sincronizzazione. Mescolare 10 millilitri di candeggina, 2,5 millilitri di idrossido di sodio e 37,5 millilitri di acqua deionizzata in un tubo cronico da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, lavare i vermi adulti gravidi da almeno quattro piastre con tampone M9 e trasferirli in una provetta da 15 millilitri.
Ruotare quel 716 G per un minuto a temperatura ambiente e quindi rimuovere il super natante usando una pipetta di trasferimento. Aggiungere 10 millilitri della soluzione sbiancante. Agitare delicatamente il tubo per quattro minuti fino a quando la maggior parte, ma non tutte le carcasse di vermi si sono dissolte.
Girare a 716 G per un minuto. Versare la soluzione di candeggina in un solo movimento. Finché il tubo non viene scosso a questo punto, le uova si attaccheranno al lato del tubo a 15 millilitri di tampone M9 e si invertiranno.
Ruotare a 716 G per un minuto e versare il buffer M9 con un movimento regolare. Ripetere questo lavaggio con soluzione tampone tre volte. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 10 millilitri di M9 fresco e posizionare su un rotatore durante la notte a 15 gradi Celsius per isolare una popolazione sincronizzata di animali affamati al primo stadio larvale.
Stampa su 24 pozzetti e assegna ceppi a luoghi casuali. Circa 24 ore dopo la preparazione della candeggina, spin down i vermi L1 affamati a 716 G per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere circa nove millilitri di tampone M9 con una pipetta di trasferimento di plastica, quindi mescolare delicatamente i vermi del primo stadio larvale affamati nel restante tampone M9.
Pipettare immediatamente tre microlitri di vermi e tampone M9 su un vetrino da microscopio e determinare il numero di L1. Il numero desiderato è da 20 a 30 L1 in tre microlitri. Pipettare tre microlitri di L1 in ciascun pozzetto secondo la mappa delle piastre prefabbricata, lasciare che i vermi crescano fino all'età adulta per tre giorni a 20 gradi Celsius.
Stampare il foglio dati vuoto che verrà utilizzato per registrare il numero di vermi che si muovono in ciascun pozzetto ogni cinque minuti per un'ora. Controllare i vermi nelle piastre da 24 pozzetti. Usando un pennarello, fai una X sul coperchio della piastra su tutti i pozzi che hanno contaminazione, sono affamati o hanno troppi vermi, il che renderà difficile il conteggio.
Produrre una soluzione di levamisolo da 0,4 millimolari aggiungendo 200 microlitri di materiale di levamisolo da 100 millimolari a 50 millilitri di M9. Avviare un timer e quindi utilizzare una pipetta di trasferimento aggiungere un millilitro di 0,4 millimolari di levamisolo ai primi due pozzetti, in modo che gli animali nuotino liberamente. Continuare ad aggiungere Levamisolo ai pozzi adiacenti, scaglionando il tempo in base al numero di pozzi da saggiare. Dopo cinque minuti, iniziare a contare manualmente solo il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto, iniziando dal primo pozzo, e registrare quel numero sul foglio dati.
Continua a contare il numero di vermi in movimento in ciascun pozzetto ogni cinque minuti per un'ora. Alla fine del test o quando il tempo lo consente, registrare il numero totale di vermi in ciascun pozzetto. Ottenere la piastra, mappare e registrare quale ceppo corrisponde a ciascun pozzetto.
Inserisci i dati in un foglio di calcolo che inizia con il numero totale di vermi in ciascun pozzetto e organizzandoli per genotipo. Combinando i dati provenienti dai pozzi, determinare il numero di vermi che si muovono in ogni punto temporale. Usa questo per calcolare il numero che paralizza in ogni punto temporale.
Creare una tabella di dati in modo tale che la colonna di sinistra indichi l'ora e le colonne successive contengano i dati per ogni ceppo. Per ogni animale paralizzato entro i primi cinque minuti, crea una riga e inseriscine una per cinque minuti. Ripeti questa operazione per ogni punto temporale.
Per tutti gli animali che non paralizzano entro la fine del test, inserire uno zero per 60 minuti. Utilizzare questi dati per creare una curva di sopravvivenza nel software statistico specifico utilizzato qui per visualizzare visivamente la paralisi dipendente dal tempo della popolazione. I dati relativi a tutti i ceppi analizzati devono essere inseriti nella stessa tabella di dati, lasciando gli spazi necessari.
Mutazioni nelle subunità del recettore dell'acetilcolina levamisolo, così come nei geni necessari per il raggruppamento dei recettori dell'acetilcolina sensibili al levamisolo post-sinaptici, causano resistenza alla paralisi indotta dal levamisolo come osservato rispettivamente nei mutanti unc-63 e Lev-10. La perdita del canale ionico GABA-dipendente unc-49 ha causato ipersensibilità al levamisolo a causa dell'interruzione del corretto equilibrio della segnalazione colinergica e GABAergica. La corretta preparazione di 24 piastre di pozzetto è essenziale.
Se i prati batterici non sono asciutti prima di individuare L1, la soluzione di levamisolo può diventare torbida durante il test, il che inibisce l'osservazione. Modificando le 24 piastre del pozzetto, questo protocollo può essere eseguito con animali abbattuti con RNAi. Ciò consente ai ricercatori di studiare i geni di C-elgan, per i quali i mutanti non sono disponibili.
