私たちのプロトコルは、骨格筋などの組織がどのようにそのサイズを調節するかを研究することを可能にし、これは重要な生理学的および医学的意味を持つ細胞および発生生物学の重要な問題であり続けています。私たちの技術の主な利点は、生体内の生きた動物において、高度な空間的および時間的精度で細胞増殖を観察および測定できることです。初期の筋肉成長に関する基本的な理解の進歩は、初期の筋肉の問題の発達的起源を浮き彫りにし、高齢者や筋肉消耗障害のある患者の筋肉喪失から保護するためのノボセラピューティクスの発見につながる可能性があります。
1.5ミリリットルのチューブに1%LMAを準備し、繰り返し使用するために摂氏37度のヒートブロックに保管してください。マウントする魚を選択し、各魚を一過性に麻酔します。ヒートショックを避けるために、ヒートブロックからLMAアリコートを取り外し、設定のすぐ上まで冷まします。
1%LMAの層でコーティングされた60ミリリットルのペトリ皿を取り、解剖顕微鏡のステージに置きます。幼虫を1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットで60ミリメートルコーティングされたペトリ皿に移し、できるだけ多くの移した培地を取り除きます。次に、パスツールピペットを使用して、LMAを数滴魚の上に置き、LMAが固まる前に、鉗子または火で磨かれた細かいガラス針を使用して、前後軸と背腹軸を水平から10度以内にして、LMAの上面近くに幼虫をすばやく向けます。
または、1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用してください。最小限の魚の培地で幼虫を収集し、幼虫を冷却されたLMAのアリコートに移します。幼虫を5秒間沈めて、LMAに完全に囲まれます。
次に、幼虫を回収し、LMAを一滴入れてアガロースでコーティングしたペトリ皿に移します。前に示したように幼虫をすばやく配置します。幼虫がアガロースドロップの表面近くに水平に正しく取り付けられていない場合は、取り外して再埋め込み、1ミリリットルのプラスチックパスツールピペットを使用して穏やかに吸引することで幼虫を簡単に回収でき、LMAはケムワイプを使用して穏やかに除去できます。
LMA が設定されるまで約 10 分間待ちます。約10ミリリットルのトリカイン含有魚培地で皿をあふれさせます。共焦点スタックをキャプチャするには、アガロースの腫れが発生するため、スキャンする前にマウントされた魚を少なくとも10分間休ませます。
サンプルディッシュを共焦点システムのステージにロードします。幼虫を見つけて、目的の体節に焦点を合わせます。Somite 17は、肛門ベント付近の局在化が容易で、イメージングが容易であるため、選択することができる。
前部から体節を数えて確認してください。YZ画像をキャプチャするには、Zスタックをキャプチャするように設定します。魚の上点と下点を定義することから始めます。
左側と右側の両方を必要に応じてキャプチャできるため、すべての高速YZスキャンで目的の領域を確実にキャプチャできます。共焦点ソフトウェアが許す限り、魚のスキャンエリアの向きを変えます。魚を前後軸で配置し、画像デックス軸に平行に、背腹軸をY軸に平行に配置し、フィールドの中央に体節17を配置します。
最上部の筋腫の中層平面に焦点を当て、上軸および催眠体体の半分全体が垂直および水平の筋隔壁とともに表示され、高解像度のXY画像をキャプチャします。ファイルに名前を付けて、画像を保存します。YZ画像をキャプチャするには、選択した体節を横切って、魚の前後軸に垂直な正確な背側から腹側の線を描きます。
選択した前後位置を追加してから、Zスタックラインスキャンを実行します。選択した筋腫に沿った定義された前後位置でYZラインスキャンを3回繰り返して、YZA、YZM、およびYZPをキャプチャします。これらの画像に名前を付けて、関連するXY画像とともに保存します。
このプロトコルは4スライス法と呼ばれ、画像はZenソフトウェアまたはImageJを使用して分析できます。刺激チャンバーを作成するには、6 x 35ミリメートルのウェルプレートを取り、細いはんだごてを使用して、直径5ミリメートル未満の2つの小さな開口部を各ウェルの両側に1センチメートル離して作成します。一度作成した刺激室は再利用できます。
各ウェルの開口部に一対の銀線または白金線を通します。再利用可能な接着剤を開口部の近くに塗布して、ワイヤーを所定の位置に保ち、ワイヤー間の1センチメートルの間隔を確保できます。受精後3日目に、魚を3つの条件、魚の中程度の対照、不活性および不活性に加えて茎に分けます。
不活性および不活性プラスステムグループの場合、受精後72時間に幼虫を0.6ミリモルのトリカインで麻酔します。魚のミディアムコントロールの魚の場合は、麻酔をかけずに残しておきます。魚の培地に60ミリリットルの2%アガロースを準備します。
電子レンジでよく溶かし、冷まします。次にトリカインを加え、刺激室の各ウェルに少なくとも4ミリリットルを注ぎます。すぐに電極間にカスタムメイドの4ウェルコームを追加します。
ゲルが固まるまで10分待ちます。櫛を慎重に取り外して、4つの長方形のウェルを作成します。各ウェルをトリカイン水で満たし、マイクロピペットを使用して各ウェルに麻酔をかけた不活性な茎の幼虫を1つ置き、電極に垂直な前後アクセスを行います。
解剖蛍光顕微鏡で、各魚が各チャンバー内で完全に麻酔されているかどうかを確認します。チャンバーの片側の各電極に接続されたワニのクリップを使用して、極性コントローラーを介して調整可能な電気生理学的パターン生成刺激装置をチャンバーに接続します。それからテキスト原稿に記載されているように魚を刺激します。
定期的に顕微鏡でチェックして、魚が刺激されていることを確認してください。電気刺激は、記載されたパラメータに従って、5秒に1回、目に見える両側収縮およびわずかな動きを誘発するはずである。刺激後、プラスチック製のピペットで魚を静かに洗い流して各ウェルから魚を慎重に取り出し、新鮮なトリカイン含有魚培地でインキュベーターに戻します。
チャンバー内からトリカイン水を注ぎ、鉗子を使用して各ウェルからアガロースを切断して除去し、ウェルを水道水ですすぎ、乾燥させます。4スライス法と呼ばれる筋肉サイズの分析のために、ゼブラフィッシュ仔魚の筋肉のXYおよびYZ画像を取得し、体節体積を計算しました。4スライス法とフルスタック法の間には強い相関が見られたが、4スライス法の方がわずかに大きな体積推定値を示した。
体節16と18の隣接する筋腫の体積分析により、各体節は後ろの体節よりも約7%大きいことが明らかになりました。さらなる調査により、1回のYZ測定のみを必要とする2スライス法により、筋腫体積のかなり正確な推定が得られることが明らかになりました。筋腫は受精後2日から5日の間に長さと断面積が検出可能に成長し、体積が着実に増加しました。
受精後3日目から4日目にかけてトリカイン麻酔により不活性となった筋肉は有意に体積が減少し、幼虫の筋肉の成長は活動依存的であることが示唆された。受精後4日目に筋腫体積を測定する場合、受精後3日目および4日目に個々の魚を測定する場合と比較して、筋腫サイズの減少に大きな変動が観察されました。それにもかかわらず、筋腫測定のいずれの方法間でも筋腫体積に有意差は観察されなかった。
筋腫内の線維数と平均線維体積の測定により、活動が成長の両方の細胞側面を制御していることが明らかになりました。作りたてのトリカインを使用して幼虫が完全に麻酔されていることを確認してください。部分麻酔はさまざまな結果につながります。
私たちが知っているように、幼虫は電気刺激に対してより激しく反応します。この方法は、ダウンストリームトランスクリプトミクスおよび薬理学的実験と組み合わせることで、フォースセンシングが骨格筋の成長をどのように促進するかについての新しい洞察を明らかにしました。
