Наш протокол позволяет нам изучать, как ткани, такие как скелетные мышцы, регулируют их размер, что остается ключевым вопросом в клеточной биологии и биологии развития с важными физиологическими и медицинскими последствиями. Основным преимуществом нашей методики является то, что клеточный рост можно наблюдать и измерять у живых животных in vivo с высокой степенью пространственной и временной точности. Прогресс в базовом понимании раннего роста мышц может подчеркнуть происхождение ранних мышечных проблем и привести к открытию Novo Therapeutics для защиты от потери мышечной массы у пожилых людей и пациентов с расстройствами мышечной атрофии.
Приготовьте 1% LMA в 1,5-миллилитровой трубке и держите его в тепловом блоке с температурой 37 градусов Цельсия для повторного использования. Выберите рыбу для установки и временно обезболивайте каждую рыбу. Чтобы избежать теплового удара, снимите аликвоту LMA с теплового блока и дайте ему остыть до уровня чуть выше настройки.
Возьмите 60-миллилитровую чашку Петри, которая была покрыта слоем 1% LMA, и поместите ее на сцену рассекающего микроскопа. Переложите личинку с помощью пластиковой пипетки Пастера в один миллилитр на 60-миллиметровую чашку Петри с покрытием и удалите как можно больше переносимой среды. Затем, все еще используя пипетку Пастера, поместите несколько капель LMA на рыбу и быстро сориентируйте личинку вблизи верхней поверхности LMA с ее переднезадней и дорсовентральной осью в пределах 10 градусов от горизонтали, используя щипцы или огнеполированную, тонкую стеклянную иглу до того, как LMA зайдет.
В качестве альтернативы используйте пластиковую пипетку Пастера в один миллилитр. Соберите личинок с минимальной рыбьей средой и перенесите личинок в аликвоту охлажденного LMA. Позвольте личинке утонуть в течение пяти секунд, чтобы полностью окружиться LMA.
Затем извлеките личинку и перенесите ее в капле LMA на чашку Петри, покрытую агарозами. Быстро позиционируйте личинку, как было показано ранее. Если личинки неправильно установлены горизонтально вблизи поверхности капли агарозы, удаляются и повторно встраиваются, личинки могут быть легко извлечены путем мягкого всасывания с использованием пластиковой пипетки Пастера в один миллилитр, а LMA может быть аккуратно удалена с помощью химических салфеток.
Подождите около 10 минут, пока LMA не установится. Наполните блюдо примерно 10 миллилитрами трикаинсодержащей рыбной среды. Чтобы захватить конфокальные стопки, дайте навесной рыбе отдохнуть не менее 10 минут перед сканированием, так как происходит отек агарозы.
Загрузите пробную посуду на стадию конфокальной системы. Найдите личинок и сосредоточьтесь на нужном сомите. Somite 17 может быть выбран из-за его легкости локализации вблизи анального отверстия и легкости визуализации.
Проверьте, отсчитав сомиты с передней части. Для захвата изображений YZ настройте так, как будто они захватывают стек Z. Начните с определения верхней и нижней точек рыбы.
Как левая, так и правая стороны могут быть захвачены по желанию, гарантируя, что все быстрые сканирования YZ захватывают желаемые области. Ориентируйте область сканирования для рыбы, как позволяет конфокальное программное обеспечение. Расположите рыбу с переднезадней осью, параллельной оси dex изображения и дорсовентральной оси параллельно оси Y с сомитом 17 в центре поля.
Сосредоточьтесь на плоскости среднего уровня в самом верхнем миотоме, в которой видны целые эпаксиальная и гипаксиальная половинки сомита вместе с вертикальной и горизонтальной миосептой и захватывают изображение высокого разрешения XY. Присвойте файлу имя и сохраните изображение. Чтобы захватить изображения YZ, нарисуйте точную дорсальную и вентральную линию через выбранный сомит, перпендикулярную переднезадней оси рыбы.
Добавьте выбранное переднезаднее положение, затем выполните сканирование линии стека Z. Повторите сканирование линии YZ три раза в определенных переднезадречных положениях вдоль выбранного миотома, чтобы захватить YZA, YZM и YZP. Присвойте этим изображениям имя и сохраните их вместе с соответствующим изображением XY.
Этот протокол был назван методом четырех срезов, и изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения Zen или ImageJ. Чтобы создать стимулирующую камеру, возьмите пластину скважины размером шесть на 35 миллиметров и создайте два небольших отверстия диаметром менее пяти миллиметров, по одному сантиметру друг от друга с каждой стороны каждой скважины, используя узкий паяльник. После создания стимулирующая камера может быть использована повторно.
Проденьте пару серебряных или платиновых проволок через отверстия каждой скважины. Многоразовый клейкий материал можно наносить возле отверстий, чтобы удерживать провода на месте и обеспечивать сантиметровое расстояние между проводами. Через три дня после оплодотворения разделите рыбу на три условия: контроль среды рыбы, неактивный и неактивный плюс стебель.
Для неактивных и неактивных плюс стволовые группы обезболивают личинок через 72 часа после оплодотворения 0,6 миллимолярным трикаином. Для рыб среднего контроля рыб оставьте их неанестезированными. Приготовьте 60 миллилитров 2% агарозы в рыбной среде.
Тщательно расплавите его с помощью микроволновой печи и дайте остыть. Затем добавьте трикаин и налейте не менее четырех миллилитров в каждую лунку стимулирующей камеры. Немедленно добавьте изготовленные на заказ четырехлуночные гребни между электродами.
Дайте 10 минут, чтобы гель сложился. Аккуратно удалите гребни, чтобы создать четыре прямоугольных колодца. Наполните каждую лунку трикановой водой и поместите одну анестезированную, неактивную плюс стволовую личинку в каждую лунку, используя микропипетку, с их переднезадным доступом перпендикулярно электродам.
Проверьте под рассекающим флуоресцентным микроскопом, полностью ли обезличена каждая рыба в каждой камере. Подключите регулируемый электрофизиологический, генерирующий паттерн стимулятор к камере через контроллер полярности, используя крокодиловые зажимы, соединенные с каждым электродом с одной стороны камеры. Затем стимулируйте рыбу, как описано в тексте рукописи.
Регулярно проверяйте под микроскопом, чтобы убедиться, что рыбы стимулируются. Электрический раздражитель должен вызывать видимое двустороннее сокращение и незначительное движение один раз в пять секунд после описанных параметров. После стимуляции осторожно извлеките рыбу из каждой лунки, осторожно смыв ее пластиковой пипеткой и верните в инкубатор в свежей, содержащей трикан рыбу среде.
Вылейте трикановую воду из камеры и используйте щипцы, чтобы разрезать и удалить агарозу из каждого колодца, промыть колодцы водопроводной водой и дать им высохнуть. Для анализа размера мышц, называемого методом четырех срезов, были получены изображения XY и YZ личиночной мышцы рыбок данио и рассчитан объем сомита. Наблюдалась сильная корреляция между методами с четырьмя срезами и полным стеком, хотя метод четырех срезов дал несколько большую оценку объема.
Объемный анализ соседних миотом сомитов 16 и 18 показал, что каждый сомит был примерно на 7% больше, чем тот, что позади. Дальнейшие исследования показали, что метод двух срезов, требующий только одного измерения YZ, дал достаточно точную оценку объема миотомы. Миотома заметно выросла в длину и площадь поперечного сечения между двумя и пятью днями после оплодотворения, что привело к устойчивому увеличению объема.
Мышцы, ставшие неактивными анестетиком трикаином между третьим и четвертым днем после оплодотворения, значительно уменьшили объем, что указывает на то, что рост личиночных мышц зависел от активности. Большие вариации в уменьшении размера миотомы наблюдались при измерении объема миотомы через четыре дня после оплодотворения, по сравнению с измерением каждой отдельной рыбы через три и четыре дня после оплодотворения. Тем не менее, не наблюдалось существенной разницы в объеме миотома между любыми методами измерения миотомы.
Измерение количества волокон в миотоме, а также среднего объема клетчатки показало, что активность контролирует оба клеточных аспекта роста. Убедитесь, что личинки полностью обезболены с использованием свежеприготовленного трикаина. Частичная анестезия приведет к переменному результату.
Как известно, личинки более энергично реагируют на электрическую стимуляцию. Этот метод, в сочетании с последующей транскриптомикой и фармакологическими экспериментами, выявил новые идеи о том, как ощущение силы стимулирует рост скелетных мышц.
