Notre protocole nous permet d’étudier comment les tissus, tels que les muscles squelettiques, régulent leur taille, ce qui reste une question clé en biologie cellulaire et du développement avec d’importantes implications physiologiques et médicales. Le principal avantage de notre technique est que la croissance cellulaire peut être observée et mesurée chez des animaux vivants in vivo avec un haut degré de précision spatiale et temporelle. Les progrès dans la compréhension de base de la croissance musculaire précoce peuvent mettre en évidence les origines développementales des problèmes musculaires précoces et conduire à la découverte de Novo Therapeutics pour protéger contre la perte musculaire chez les personnes âgées et les patients souffrant de troubles de la fonte musculaire.
Préparez 1% de LMA dans un tube de 1,5 millilitre et conservez-le dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius pour une utilisation répétée. Choisissez les poissons à monter et anesthésiez temporairement chaque poisson. Pour éviter les chocs thermiques, retirez la partie aliquote LMA du bloc thermique et laissez-la refroidir juste au-dessus.
Prenez une boîte de Petri de 60 millilitres qui a été recouverte d’une couche de 1% de LMA et placez-la sur la scène d’un microscope à dissection. Transférer la larve avec une pipette Pasteur en plastique d’un millilitre sur une boîte de Petri revêtue de 60 millimètres et retirer autant de milieu transféré que possible. Ensuite, toujours à l’aide de la pipette Pasteur, placez quelques gouttes de LMA sur le poisson et orientez rapidement la larve près de la surface supérieure du LMA avec ses axes antéropostérieur et dorso-ventral à moins de 10 degrés de l’horizontale, à l’aide d’une pince ou d’une aiguille de verre fine polie au feu avant que le LMA ne prenne.
Vous pouvez également utiliser une pipette Pasteur en plastique d’un millilitre. Recueillir les larves avec un minimum de milieu de poisson et transférer les larves dans l’aliquote de LMA refroidi. Laissez la larve couler pendant cinq secondes pour être entièrement entourée de LMA.
Ensuite, récupérez la larve et transférez-la dans une goutte de LMA sur la boîte de Petri enrobée d’agarose. Positionnez rapidement la larve comme démontré précédemment. Si les larves ne sont pas correctement montées horizontalement près de la surface de la goutte d’agarose, retirez-les et ré-encastrez-les, les larves peuvent être facilement récupérées par aspiration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique d’un millilitre et le LMA peut être retiré doucement à l’aide de lingettes chimiques.
Attendez environ 10 minutes jusqu’à ce que LMA se définisse. Inonder le plat avec environ 10 millilitres de milieu de poisson contenant de la tricaïne. Pour capturer les piles confocales, laissez reposer le poisson monté pendant au moins 10 minutes avant de scanner, car un gonflement de l’agarose se produit.
Chargez l’échantillon de la capsule au stade du système confocale. Localisez les larves et concentrez-vous sur le somite désiré. Somite 17 peut être choisi en raison de sa facilité de localisation près de l’évent anal et de sa facilité d’imagerie.
Vérifiez en comptant les somites de l’antérieur. Pour capturer des images YZ, configurez comme pour capturer une pile Z. Commencez par définir les points supérieurs et inférieurs du poisson.
Les côtés gauche et droit peuvent être capturés comme vous le souhaitez, garantissant que tous les balayages YZ rapides capturent les régions souhaitées. Orientez la zone de balayage pour le poisson comme le permet le logiciel confocale. Positionnez le poisson avec l’axe antéropostérieur, parallèle à l’axe dex image et l’axe dorso-ventral parallèle à l’axe Y avec somite 17 au centre du champ.
Concentrez-vous sur un plan de niveau moyen dans le myotome supérieur, dans lequel l’ensemble des moitiés du somite épaxial et hypaxial, ainsi que les myosepta verticaux et horizontaux sont visibles et capturez une image XY haute résolution. Nommez le fichier et enregistrez l’image. Pour capturer les images YZ, tracez une ligne dorsale à ventrale précise à travers le somite choisi, perpendiculaire à l’axe antéropostérieur du poisson.
Ajoutez une position antéropostérieure sélectionnée, puis effectuez un balayage de ligne de pile Z. Répétez le balayage de la ligne YZ trois fois à des positions antéropostérieures définies le long du myotome sélectionné pour capturer YZA, YZM et YZP. Nommez et enregistrez ces images avec l’image XY associée.
Ce protocole a été appelé la méthode des quatre tranches et les images peuvent être analysées à l’aide du logiciel Zen ou d’ImageJ. Pour créer une chambre de stimulation, prenez une plaque de puits de six par 35 millimètres et créez deux petites ouvertures de moins de cinq millimètres de diamètre, espacées d’un centimètre de chaque côté de chaque puits, à l’aide d’un fer à souder étroit. Une fois créée, la chambre de stimulation peut être réutilisée.
Enfilez une paire de fils d’argent ou de platine à travers les ouvertures de chaque puits. Le matériau adhésif réutilisable peut être appliqué près des ouvertures pour maintenir les fils en place et assurer une séparation d’un centimètre entre les fils. Trois jours après la fertilisation, diviser le poisson en trois conditions, le milieu de poisson témoin, inactif et inactif plus la tige.
Pour les groupes souches plus inactifs et inactifs, anesthésier les larves 72 heures après la fécondation avec 0,6 millimolaire de tricaïne. Pour les poissons de contrôle du milieu de poisson, laissez-les non anesthésiés. Préparer 60 millilitres d’agarose à 2% dans un milieu de poisson.
Faites-le fondre soigneusement à l’aide d’un micro-ondes et laissez-le refroidir. Ajoutez ensuite la tricaïne et versez au moins quatre millilitres dans chaque puits de la chambre de stimulation. Ajoutez immédiatement des peignes sur mesure à quatre puits entre les électrodes.
Laissez reposer 10 minutes pour que le gel prenne. Retirez soigneusement les peignes pour créer quatre puits rectangulaires. Remplissez chaque puits avec de l’eau tricaïne et placez une seule larve de tige anesthésiée, inactive et dans chaque puits à l’aide d’une micropipette, avec leur accès antéropostérieur perpendiculaire aux électrodes.
Vérifiez sous le microscope fluorescent à dissection si chaque poisson est complètement anesthésié dans chaque puits de chambre. Connectez un stimulateur électrophysiologique réglable générant des motifs à la chambre via un contrôleur de polarité, à l’aide de pinces crocodiles connectées à chaque électrode d’un côté de la chambre. Ensuite, stimulez le poisson comme décrit dans le manuscrit du texte.
Vérifiez régulièrement au microscope pour confirmer que les poissons sont stimulés. Le stimulus électrique doit induire une contraction bilatérale visible et un léger mouvement une fois toutes les cinq secondes suivant les paramètres décrits. Après la stimulation, retirez soigneusement les poissons de chaque puits en les rinçant doucement avec une pipette en plastique et retournez dans l’incubateur dans un milieu de poisson frais contenant de la tricaine.
Versez l’eau de tricaïne de l’intérieur de la chambre et utilisez des pinces pour couper et enlever l’agarose de chaque puits, rincez les puits avec de l’eau du robinet et laissez-les sécher. Pour l’analyse de la taille du muscle, appelée méthode des quatre tranches, des images XY et YZ du muscle larvaire du poisson zèbre ont été obtenues et le volume de somite a été calculé. Une forte corrélation a été observée entre les méthodes à quatre tranches et à empilement complet, bien que la méthode à quatre tranches ait donné une estimation de volume légèrement plus importante.
L’analyse volumétrique des myotomes adjacents des somites 16 et 18 a révélé que chaque somite était environ 7% plus grand que celui derrière. Une enquête plus approfondie a révélé qu’une méthode à deux tranches, ne nécessitant qu’une seule mesure YZ, donnait une estimation raisonnablement précise du volume de myotome. Le myotome a augmenté de manière détectable en longueur et la section transversale entre deux et cinq jours après la fécondation, conduisant à une augmentation constante du volume.
Le muscle rendu inactif par la tricaïne anesthésique entre le troisième et le quatrième jour après la fécondation avait considérablement réduit le volume, indiquant que la croissance musculaire larvaire dépendait de l’activité. Une plus grande variation dans la réduction de la taille du myotome a été observée lors de la mesure du volume du myotome quatre jours après la fécondation, par rapport à la mesure de chaque poisson individuel trois et quatre jours après la fécondation. Néanmoins, aucune différence significative n’a été observée dans le volume du myotome entre les deux méthodes de mesure du myotome.
La mesure du nombre de fibres dans le myotome, ainsi que du volume moyen de fibres, a révélé que l’activité contrôle les deux aspects cellulaires de la croissance. Assurez-vous que les larves sont complètement anesthésiées à l’aide de tricaïne fraîchement préparée. Une anesthésie partielle conduirait à un résultat variable.
Comme nous le savons, les larves réagissent plus vigoureusement à la stimulation électrique. Cette méthode, combinée à la transcriptomique en aval et à des expériences pharmacologiques, a révélé de nouvelles perspectives sur la façon dont la détection de la force stimule la croissance du muscle squelettique.
