우리의 프로토콜을 통해 골격근과 같은 조직이 크기를 조절하는 방법을 연구 할 수 있으며, 이는 중요한 생리 학적 및 의학적 의미를 지닌 세포 및 발달 생물학의 핵심 질문으로 남아 있습니다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 높은 수준의 공간적 및 시간적 정확도로 생체 내에서 살아있는 동물에서 세포 성장을 관찰하고 측정 할 수 있다는 것입니다. 초기 근육 성장에 대한 기본적인 이해의 진전은 초기 근육 문제의 발달 기원을 강조하고 노인 및 근육 소모성 장애 환자의 근육 손실을 예방하는 Novo Therapeutics의 발견으로 이어질 수 있습니다.
1.5 밀리리터 튜브에 1 % LMA를 준비하고 반복 사용을 위해 섭씨 37 도의 열 블록에 보관하십시오. 장착 할 물고기를 선택하고 각 물고기를 일시적으로 마취하십시오. 열 충격을 방지하려면 열 블록에서 LMA 부분 표본을 제거하고 설정 바로 위까지 식히십시오.
1 % LMA 층으로 코팅 된 60 밀리리터 페트리 접시를 가져 와서 해부 현미경 스테이지에 놓습니다. 1 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 유충을 60mm 코팅 된 페트리 접시에 옮기고 가능한 한 많은 배지를 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 LMA 몇 방울을 물고기에 떨어뜨리고 LMA가 설정되기 전에 집게나 불광택이 나는 가는 유리 바늘을 사용하여 LMA의 전후 및 배복부 축이 수평에서 10도 이내인 LMA의 윗면 근처에 유충의 방향을 빠르게 향하게 합니다.
또는 1밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 최소 어류 배지로 유충을 수집하고 유충을 냉각 된 LMA의 부분 표본으로 옮깁니다. 유충이 LMA에 완전히 둘러싸이도록 5 초 동안 가라 앉히십시오.
그런 다음 유충을 회수하여 LMA 한 방울로 아가 로스 코팅 페트리 접시에 옮깁니다. 앞에서 설명한대로 유충을 빠르게 배치하십시오. 유충이 아가 로스 방울의 표면 근처에 수평으로 올바르게 장착되지 않은 경우 제거하고 다시 삽입하면 1 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 흡입으로 유충을 쉽게 검색 할 수 있으며 LMA는 화학 물티슈를 사용하여 부드럽게 제거 할 수 있습니다.
LMA가 설정될 때까지 약 10분 동안 기다립니다. 접시에 약 10밀리리터의 트리카인 함유 생선 배지를 가득 채웁니다. 공초점 스택을 캡처하려면 아가로스 팽창이 발생하므로 스캔하기 전에 장착된 물고기를 최소 10분 동안 그대로 두십시오.
샘플 접시를 공초점 시스템의 스테이지에 로드합니다. 유충을 찾아 원하는 체절에 집중하십시오. Somite 17은 항문 통풍구 근처의 국소화가 용이하고 이미징이 쉽기 때문에 선택 될 수 있습니다.
앞쪽에서 체세포를 세어 확인하십시오. YZ 이미지를 캡처하려면 Z 스택을 캡처하는 것처럼 설정합니다. 물고기의 상단과 하단을 정의하는 것으로 시작하십시오.
왼쪽과 오른쪽 모두 원하는 대로 캡처할 수 있으므로 모든 빠른 YZ 스캔이 원하는 영역을 캡처할 수 있습니다. 컨포칼 소프트웨어가 허용하는 대로 물고기의 스캔 영역 방향을 지정합니다. 이미지 dex 축과 평행하게 하고 등쪽 축을 Y축과 평행하게 하고 등쪽 축을 필드 중앙에 소마이트 17로 배치합니다.
수직 및 수평 근중격과 함께 전체 에축 및 최면 소마이트 반쪽이 보이고 고해상도 XY 이미지를 캡처하는 최상단 근종의 중간 평면에 초점을 맞춥니다. 파일 이름을 지정하고 이미지를 저장합니다. YZ 이미지를 캡처하려면 물고기의 전후 축에 수직 인 선택한 체절을 가로 질러 정확한 등쪽에서 복부 선을 그립니다.
선택한 전후 위치를 추가한 다음 Z 스택 라인 스캔을 수행합니다. YZA, YZM 및 YZP를 포착하기 위해 선택한 근종을 따라 정의된 전후 위치에서 YZ 라인 스캔을 세 번 반복합니다. 이러한 이미지의 이름을 지정하고 관련 XY 이미지와 함께 저장합니다.
이 프로토콜은 4 슬라이스 방법이라고하며 Zen 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다. 자극 챔버를 만들려면 6 x 35mm 웰 플레이트를 가져 와서 좁은 납땜 인두를 사용하여 각 우물의 각면에 1cm 간격으로 직경이 5mm 미만인 두 개의 작은 구멍을 만듭니다. 일단 생성되면 자극 챔버를 재사용 할 수 있습니다.
각 우물의 구멍을 통해 한 쌍의은 또는 백금 와이어를 끼 웁니다. 재사용 가능한 접착 재료는 개구부 근처에 적용하여 와이어를 제자리에 유지하고 와이어 사이에 1cm 간격을 유지할 수 있습니다. 수정 후 3 일에 물고기를 물고기 중간 제어, 비활성 및 비활성 플러스 줄기의 세 가지 조건으로 나눕니다.
비활성 및 비활성 플러스 줄기 그룹의 경우, 수정 후 72 시간에 유충을 0.6 밀리몰 트리카인으로 마취하십시오. 물고기 매체 대조 물고기의 경우 마취되지 않은 상태로 두십시오. 어류 배지에 60 밀리리터의 2 % 아가 로스를 준비하십시오.
전자 레인지로 완전히 녹여 식히십시오. 그런 다음 트리카인을 넣고 자극 챔버의 각 우물에 적어도 4 밀리리터를 붓습니다. 전극 사이에 맞춤형 4 웰 빗을 즉시 추가하십시오.
젤이 굳을 때까지 10 분 정도 기다리십시오. 빗을 조심스럽게 제거하여 4 개의 직사각형 우물을 만듭니다. 각 우물을 트리카인 물로 채우고 마이크로 피펫을 사용하여 각 우물에 단일 마취 된 비활성 플러스 줄기 유충을 배치하고 전후방 접근이 전극에 수직으로 있습니다.
해부 형광 현미경으로 각 물고기가 각 챔버 웰 내에서 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 챔버의 한쪽에 있는 각 전극에 연결된 악어 클립을 사용하여 극성 컨트롤러를 통해 조정 가능한 전기 생리학, 패턴 생성 자극기를 챔버에 연결합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명 된대로 물고기를 자극하십시오.
현미경으로 정기적으로 확인하여 물고기가 자극되고 있는지 확인하십시오. 전기 자극은 설명 된 매개 변수에 따라 5 초마다 한 번씩 가시적 인 양측 수축과 약간의 움직임을 유도해야합니다. 자극 후 플라스틱 피펫으로 부드럽게 씻어내어 각 우물에서 물고기를 조심스럽게 제거하고 신선한 트리카인이 함유 된 생선 배지에서 인큐베이터로 돌아갑니다.
챔버 내에서 트리카인 물을 붓고 집게를 사용하여 각 우물에서 아가 로스를 자르고 제거하고 우물을 수돗물로 헹구고 건조시킵니다. 4 슬라이스 방법이라고 불리는 근육 크기 분석을 위해 제브라 피쉬 유충 근육의 XY 및 YZ 이미지를 얻고 체석 부피를 계산했습니다. 4 개의 슬라이스 방법과 전체 스택 방법 사이에 강한 상관 관계가 관찰되었지만 4 슬라이스 방법은 약간 더 큰 부피 추정치를 제공했습니다.
체세포 16과 18의 인접한 근종의 체적 분석 결과 각 체석이 뒤에있는 것보다 약 7 % 더 큰 것으로 나타났습니다. 추가 조사에 따르면 단일 YZ 측정 만 필요한 두 슬라이스 방법이 근종 부피를 합리적으로 정확하게 추정 한 것으로 나타났습니다. 근종은 수정 후 2 일에서 5 일 사이에 길이와 단면적이 눈에 띄게 성장하여 부피가 꾸준히 증가했습니다.
수정 후 3 일에서 4 일 사이에 마취 트리카인에 의해 비활성화 된 근육은 부피가 현저히 감소하여 유충 근육 성장이 활동 의존적임을 나타냅니다. 수정 후 3 일 및 4 일에 각 개별 물고기를 측정하는 것과 비교하여 수정 후 4 일에 근종 부피를 측정 할 때 근종 크기의 감소에 더 큰 변화가 관찰되었습니다. 그럼에도 불구하고, 근종 측정의 두 방법 사이에 근종 부피에서 유의 한 차이가 관찰되지 않았다.
myotome 내의 섬유 수와 평균 섬유 부피를 측정 한 결과, 활동이 성장의 세포 측면을 모두 조절한다는 것이 밝혀졌습니다. 유충이 신선하게 준비된 트리카인을 사용하여 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 부분 마취는 다양한 결과로 이어질 것입니다.
우리가 알다시피, 유충은 전기 자극에 더 적극적으로 반응합니다. 다운스트림 전사체학 및 약리학 실험과 결합된 이 방법은 힘 감지가 골격근의 성장을 주도하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 보여주었습니다.
