このプロトコルは、C.elegansの天然微生物叢への新しい洞察を可能にします。同時に、単離された微生物は、微生物叢と宿主の相互作用およびC.elegans生物学を特徴付けるために、制御された実験室実験で使用することができます。このプロトコルは、自然界のC.elegansに関連する微生物を分離することに焦点を当てているため、この重要なモデル宿主の生物学をより自然な状況で理解するための鍵となります。
他の線虫と比較してカエノラブディティスの出現に精通していることは有用でしょう。解剖スコープでのピペッティングは最初は難しい場合がありますが、練習が役立ちます。堆肥や腐った果物などの環境サンプルを別々のビニール袋、チューブ、またはきれいな容器に集めることから始めます。
収集した環境サンプルの断片を滅菌9センチメートルの空のペトリ皿に均等に広げ、約20ミリリットルの滅菌粘性培地を加えてサンプルを培地で覆います。解剖顕微鏡下で、カエノラブディティス・エレガンスおよび関連する線虫の分離に関するガイドラインに従って、カエノラブディティス線虫を検索します。20〜100マイクロリットルのピペットを使用して、Caenorhabditis線虫を含む可能な限り少量の液体をプレートから収集し、1〜3ミリリットルの滅菌M9Tを含む3センチメートルのペトリ皿に移します。
ワーム集団を確立するために、個々のワームを線虫増殖培地またはNGMと共にプレート上に移すことができる。線虫を洗浄し、線虫の外側に存在する微生物を除去するには、それらをM9Tで10〜15分間インキュベートします。線虫を含む液体を可能な限り少量ピペットで取り出し、1〜3ミリリットルの新鮮なM9Tを含む新しい滅菌3センチメートルのペトリ皿に移します。
線虫関連微生物を公平に同定するには、直径1ミリメートルの滅菌ビーズを約3個含む96ウェルプレートを調製し、ウェルあたり19.5マイクロリットルのPCRバッファーと0.5マイクロリットルのプロテイナーゼKの混合物を加えます。単一の洗浄した線虫をできるだけ少ない液体で各ウェルに移します。移した線虫をビーズホモジナイザーを使用して30ヘルツで3分間分解し、プレートまたはチューブを室温で10秒間8, 000 Gで遠心分離して液体を底に運びます。
C.elegansを同定するには、PCRサイクラーでサンプルを摂氏50度で1時間、摂氏95度で15分間加熱して個々の線虫のDNAを分離するか、市販のキットを使用して線虫集団のDNAを分離します。単離したDNAを摂氏マイナス20度で凍結して長期保存します。DNAとプライマーペアNLP 30を順方向および逆方向に使用し、154塩基対のPCR産物を生成します。
細菌を単離するには、約3つの滅菌1ミリメートルビーズ、ウェルあたり20マイクロリットルのM9バッファーを含む96ウェルプレートを準備し、洗浄した線虫を1つピペットで各ウェルにできるだけ少ない液体でピペットで送ります。ビーズホモジナイザーを使用する前に実証されたように線虫を分解し、続いてプレートを短時間遠心分離して液体を底に運びます。完了したら、懸濁液を収集し、1〜10の割合で連続的に希釈します。
希釈した懸濁液を最大100マイクロリットル、9センチメートルの寒天プレートにプレートします。次に、プレートを摂氏15〜20度で24〜48時間インキュベートします。純粋な細菌培養物を得るには、滅菌ループまたはつまようじを使用してインキュベートプレートから単一のコロニーを選択し、精製中に使用したのと同じ寒天培地を含む新しい寒天プレートにストリークします。
プレートの1/3のみを使用するようにしてください。次に、再利用可能なループを滅菌するか、新しい滅菌ループを使用して最初のストリークにドラッグし、サンプルプレートの別の1/3部分に2番目のストリークを作成します。2番目のストリークにループをドラッグし、3番目のストリークを作成して、単一のコロニーの成長を達成することで、これを繰り返します。
単離に使用したのと同じ増殖条件下でプレートをインキュベートし、必要に応じて精製ステップを繰り返します。純粋なコロニーを液体培地中で、同じ温度および増殖条件を用いて増殖させる。次に、純粋な液体培養物から細菌DNAを抽出し、27フォワードプライマーと1495リバースプライマーを使用して16SリボソームRNAを増幅し、本文に記載されているようにPCRを行うことにより、細菌の特性評価を行います。
採取した果物や堆肥のサンプルをペトリ皿に分配し、液体または粘性のある培地に浸すと、ワームが基質材料を離れて培地の表面に泳ぎました。微生物は純粋な単一コロニーとして単離され、一部のC.elegans関連細菌はバイオフィルムを形成したり凝集しやすく、複数種の培養をもたらす可能性があるため、精製は重要な役割を果たしました。C.elegans特異的プライマー、すなわちNLP 30フォワードおよびNLP 30リバースを用いたPCRは、C.エレガンスの154塩基対産物の増幅をもたらした。
単一のワームから分離されたDNAは弱いPCRバンドをもたらしましたが、少なくとも50匹のワームからなるワーム集団からのDNA抽出は、より多く、より明確なバンドをもたらしました。C.elegans特異的PCRの成功は、微生物がいたるところにある単離された線虫のDNAと同時にポジティブコントロールとして実験室株すなわちN2のDNAを実行することによって確認された。したがって、単離された微生物が自然界のワームと真に関連していることを確認するために、無菌条件下で作業することが不可欠です。
単離された微生物は、宿主と微生物叢の相互作用、または宿主生物学における微生物の役割、例えば、制御された実験室実験における老化、発生、または免疫を研究するために使用することができる。この技術で分離された微生物は、現在、宿主の適応度に関する微生物叢の多様性や免疫に対する微生物の役割の理解を深めるために、C.elegansコミュニティによって使用されています。
