Este protocolo permite novos insights sobre a microbiota natural de C.elegans. Simultaneamente, os micróbios isolados podem ser usados em experimentos de laboratório controlados para caracterizar as interações microbiota-hospedeiro e a biologia de C.elegans. Este protocolo se concentra no isolamento de micróbios associados a C.elegans na natureza, que são, portanto, fundamentais para a compreensão da biologia deste importante hospedeiro modelo em um contexto mais natural.
Será útil estar familiarizado com a aparência da Caenorhabditis em comparação com outros nematoides. A pipetagem sob o escopo de dissecação pode inicialmente ser um desafio, mas a prática será útil. Comece coletando as amostras ambientais, como composto ou frutas podres, em sacos plásticos separados, tubos ou recipientes limpos.
Espalhe uniformemente os pedaços das amostras ambientais coletadas em uma placa de Petri vazia estéril de nove centímetros e adicione aproximadamente 20 mililitros de meio viscoso estéril para cobrir a amostra com o meio. Sob o microscópio de dissecação, procure por nematoides de Caenorhabditis seguindo as diretrizes sobre o isolamento de Caenorhabditis elegans e nematoides relacionados. Usando uma pipeta de 20 a 100 microlitros, colete a menor quantidade possível de líquido contendo os nematoides de Caenorhabditis da placa e transfira-a para a placa de Petri de três centímetros contendo um a três mililitros de M9T estéril.
Para estabelecer uma população de vermes, os vermes individuais podem ser transferidos para uma placa com um meio de crescimento de nematoides ou NGM. Para lavar os nematoides e remover os micróbios presentes fora dos nematoides, incube-os em M9T por 10 a 15 minutos. Pipetar a menor quantidade possível de líquido contendo os nemátodos e transferi-lo para uma nova placa de Petri estéril de três centímetros contendo um a três mililitros de M9T fresco.
Para a identificação imparcial de micróbios associados a nematoides, prepare uma placa de poço 96 com aproximadamente três esferas estéreis de um milímetro de diâmetro e adicione uma mistura de 19,5 microlitros de tampão de PCR e 0,5 microlitros de proteinase K por poço. Transfira um único nematoide lavado para cada poço com o mínimo de líquido possível. Quebre os nematoides transferidos usando um homogeneizador de esferas por três minutos a 30 hertz e centrifugar as placas ou tubos a 8.000 G por 10 segundos à temperatura ambiente para levar o líquido ao fundo.
Para identificar C.elegans, aqueça as amostras em um ciclador de PCR por uma hora a 50 graus Celsius e 15 minutos a 95 graus Celsius para isolar o DNA de nematoides individuais ou use kits comerciais para isolar o DNA de populações de vermes. Congele o DNA isolado a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Use o DNA e o par de iniciadores NLP 30 para frente e NLP 30 para trás e produza um produto de PCR de 154 pares de bases.
Para isolar as bactérias, prepare uma placa de 96 poços com aproximadamente três contas estéreis de um milímetro, 20 microlitros de tampão M9 por poço e pipete um único nematoide lavado para cada poço com o mínimo de líquido possível. Quebre os nematoides como demonstrado antes de usar um homogeneizador de contas, seguido de uma breve centrifugação da placa para levar o líquido ao fundo. Uma vez feito, recolha a suspensão e dilua-a em série na proporção de uma a 10.
Placa até 100 microlitros da suspensão diluída em placas de ágar de nove centímetros. Em seguida, incube as placas a 15 a 20 graus Celsius por 24 a 48 horas. Para obter a cultura bacteriana pura, escolha uma única colônia da placa incubada usando um laço estéril ou palito de dente e coloque-a em uma nova placa de ágar contendo o mesmo meio de ágar usado durante a purificação.
Certifique-se de usar apenas 1/3 da placa. Em seguida, esterilize um laço reutilizável ou use um novo laço estéril e arraste-o pela primeira raia para criar uma segunda faixa em outra parte de 1/3 da placa de amostra. Repita-o arrastando um laço através da segunda raia e criando a terceira sequência para alcançar o crescimento de uma única colônia.
Incubar a placa nas mesmas condições de crescimento utilizadas para isolamento e, se necessário, repetir o passo de purificação. Cultive as colônias puras em um meio líquido usando as mesmas condições de temperatura e crescimento. Em seguida, caracterize as bactérias extraindo o DNA bacteriano de culturas líquidas puras amplificando o RNA ribossômico 16S usando 27 primers para frente e 1495 reversos e realizando a PCR conforme descrito no texto.
Quando as amostras de frutos e composto coletadas foram distribuídas em placas de Petri e submersas em meio líquido ou viscoso, resultou na saída dos vermes do material do substrato e nado para a superfície do meio. Os micróbios foram isolados como colônias únicas puras e a purificação desempenhou um papel essencial, pois algumas bactérias associadas a C.elegans podem formar biofilmes ou se agregar facilmente, resultando em culturas multiespécies. A PCR usando os primers específicos de C.elegans, ou seja, PNL 30 para frente e PNL 30 para trás, resultou na amplificação de um produto de par de bases 154 para C.elegans.
O DNA isolado de vermes individuais resultou em bandas de PCR fracas, enquanto a extração de DNA das populações de vermes consistindo de pelo menos 50 vermes produziu uma quantidade maior e bandas mais claras. O sucesso da PCR específica de C.elegans foi confirmado pela execução do DNA de uma cepa de laboratório, ou seja, N2, como um controle positivo simultaneamente com o DNA dos nematoides isolados Os micróbios estão em toda parte. Portanto, é essencial trabalhar sob condições estéreis para garantir que os micróbios que estão isolados estejam realmente associados ao verme na natureza.
Os micróbios isolados podem ser usados para estudar as interações hospedeiro-microbiota ou o papel dos micróbios na biologia do hospedeiro, por exemplo, envelhecimento, desenvolvimento ou imunidade em experimentos laboratoriais controlados. Micróbios isolados com esta técnica são atualmente usados pela comunidade C.elegans para melhorar a compreensão da diversidade da microbiota na aptidão do hospedeiro ou o papel dos micróbios na imunidade.
