模型线虫秀丽隐杆线虫天然微生物群的分离和表征

该协议允许对秀丽隐杆线虫的天然微生物群有新的见解。同时，分离的微生物可用于受控实验室实验，以表征微生物群 - 宿主相互作用和秀丽隐杆线虫生物学。该协议侧重于分离自然界中与秀丽隐杆线虫相关的微生物，因此这是在更自然的背景下理解这一重要模型宿主的生物学的关键。

与其他线虫相比，熟悉盲肠炎的外观会有所帮助。在解剖范围内移液最初可能具有挑战性，但实践会有所帮助。首先将堆肥或腐烂的水果等环境样本收集在单独的塑料袋、管子或干净的容器中。

将收集的环境样品碎片均匀地铺在无菌的9厘米空培养皿中，并加入约20毫升无菌粘性培养基以用培养基覆盖样品。在解剖显微镜下，按照分离秀丽隐杆线虫和相关线虫的指南搜索线虫。使用20至100微升移液管，从平板中收集尽可能少量的含有Caenorhabditis线虫的液体，并将其转移到含有一至三毫升无菌M9T的三厘米培养皿中。

为了建立蠕虫种群，可以将单个蠕虫转移到带有线虫生长培养基或NGM的平板上。要清洗线虫并去除线虫外部存在的微生物，请将它们在M9T中孵育10至15分钟。移出含有线虫的尽可能少量的液体，并将其转移到含有一到三毫升新鲜M9T的新无菌三厘米培养皿中。

为了无偏地鉴定线虫相关微生物，准备一个 96 孔板，其中包含大约三个直径为 1 毫米的无菌磁珠，每孔加入 19.5 微升 PCR 缓冲液和 0.5 微升蛋白酶 K 的混合物。用尽可能少的液体将单个洗涤的线虫转移到每个孔中。使用珠子均质器在30赫兹下分解转移的线虫三分钟，并在室温下以8， 000 G离心板或管10秒钟以使液体到达底部。

要鉴定秀丽隐杆线虫，请在PCR循环仪中将样品在50摄氏度下加热1小时，在95摄氏度下加热15分钟，以分离单个线虫的DNA，或使用商业试剂盒分离蠕虫种群的DNA。将分离的DNA冷冻在零下20摄氏度下长期储存。使用 DNA 和引物对 NLP 30 正向和 NLP 30 反向，产生 154 碱基对 PCR 产物。

为了分离细菌，准备一个96孔板，其中包含大约三个无菌的一毫米珠子，每孔20微升M9缓冲液，并用尽可能少的液体将单个洗涤的线虫移液到每个孔中。如使用珠均质器之前所示分解线虫，然后对板进行短暂离心以使液体到达底部。完成后，收集悬浮液并以 1 到 10 的比例连续稀释。

将多达 100 微升的稀释悬浮液接种到 9 厘米琼脂平板上。然后将板在 15 至 20 摄氏度下孵育 24 至 48 小时。为了获得纯细菌培养物，使用无菌环或牙签从孵育板中挑选单个菌落，并将其划线到含有纯化过程中使用的相同琼脂培养基的新琼脂平板上。

确保只使用板的 1/3。然后对可重复使用的环进行灭菌或使用新的无菌环并将其拖过第一条条纹，以在样品板的另一 1/3 部分上形成第二条条纹。通过拖动穿过第二条条纹的循环并创建第三条条纹来实现单个菌落生长来重复它。

在用于分离的相同生长条件下孵育板，如果需要，重复纯化步骤。使用相同的温度和生长条件在液体培养基中培养纯菌落。接下来，通过使用 16 个正向和 1495 个反向引物扩增 27S 核糖体 RNA 并从纯液体培养物中提取细菌 DNA 并按照文本中所述进行 PCR，来表征细菌。

当收集的水果和堆肥样品分布在培养皿中并浸没在液体或粘性介质中时，导致蠕虫离开基质材料并游到培养基表面。微生物被分离为纯单菌落，纯化起着至关重要的作用，因为一些秀丽隐杆线虫相关细菌可以形成生物膜或容易聚集，从而产生多物种培养物。使用秀丽隐杆线虫特异性引物（即NLP 30正向和NLP 30反向）的PCR导致秀丽隐杆线虫的154个碱基对产物扩增。

从单个蠕虫中分离的DNA导致PCR条带较弱，而从至少50个蠕虫组成的蠕虫种群中提取DNA产生更多和更清晰的条带。秀丽隐杆线虫特异性PCR的成功是通过将实验室菌株（即N2）的DNA与分离的线虫的DNA同时运行作为阳性对照来证实的。因此，必须在无菌条件下工作，以确保那些被分离的微生物真正与自然界中的蠕虫相关。

分离的微生物可用于研究宿主-微生物群相互作用或微生物对宿主生物学的作用，例如，受控实验室实验中的衰老、发育或免疫。用这种技术分离的微生物目前被秀丽隐杆线虫群落用于提高对宿主适应性微生物群多样性或微生物对免疫作用的理解。