이 프로토콜은 C.elegans의 천연 미생물에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 동시에, 분리 된 미생물은 미생물 군-숙주 상호 작용 및 C.elegans 생물학을 특성화하기 위해 통제 된 실험실 실험에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연에서 C.elegans와 관련된 미생물을 분리하는 데 중점을 두므로 보다 자연스러운 맥락에서 이 중요한 모델 숙주의 생물학을 이해하는 데 중요합니다.
다른 선충류와 비교하여 Caenorhabditis의 출현에 익숙해지는 것이 도움이 될 것입니다. 해부 범위 내에서 파이펫팅하는 것은 처음에는 어려울 수 있지만 연습이 도움이 될 것입니다. 퇴비 또는 썩은 과일과 같은 환경 샘플을 별도의 비닐 봉지, 튜브 또는 깨끗한 용기에 수집하는 것으로 시작하십시오.
수집 된 환경 샘플 조각을 멸균 된 9cm 빈 페트리 접시에 고르게 펴고 약 20ml의 멸균 점성 배지를 추가하여 샘플을 배지로 덮습니다. 해부 현미경으로 Caenorhabditis elegans 및 관련 선충류를 분리하는 지침에 따라 Caenorhabditis 선충류를 검색하십시오. 20-100 마이크로 리터 피펫을 사용하여 플레이트에서 Caenorhabditis 선충류를 포함하는 가능한 가장 적은 양의 액체를 수집하고 1-3 밀리리터의 멸균 M9T가 들어있는 3 센티미터 페트리 접시로 옮깁니다.
벌레 개체군을 확립하기 위해 개별 벌레를 선충 성장 배지 또는 NGM이있는 판으로 옮길 수 있습니다. 선충류를 씻고 선충류 외부에 존재하는 미생물을 제거하려면 M9T에서 10-15 분 동안 배양하십시오. 선충류가 들어있는 가능한 한 적은 양의 액체를 피펫팅하여 1-3 밀리리터의 신선한 M9T가 들어있는 새로운 멸균 3 센티미터 페트리 접시로 옮깁니다.
선충 관련 미생물의 편견 없는 식별을 위해 직경 1mm의 멸균 비드 약 3개가 있는 96웰 플레이트를 준비하고 웰당 19.5마이크로리터의 PCR 완충액과 0.5마이크로리터의 프로테이나제 K의 혼합물을 추가합니다. 세척 된 단일 선충류를 가능한 한 적은 액체로 각 우물로 옮깁니다. 이송된 선충류를 비드 균질기를 사용하여 30 헤르츠에서 3분 동안 분해하고 플레이트 또는 튜브를 8, 000 G에서 실온에서 10초 동안 원심분리하여 액체를 바닥으로 가져옵니다.
C.elegans를 식별하려면 PCR 사이클러에서 샘플을 섭씨 50도에서 1시간, 섭씨 95도에서 15분 동안 가열하여 개별 선충류의 DNA를 분리하거나 상업용 키트를 사용하여 벌레 개체군의 DNA를 분리합니다. 장기 보관을 위해 분리된 DNA를 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. DNA와 NLP 30 정방향 프라이머 쌍 및 NLP 30 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 154 염기쌍 PCR 산물을 생성한다.
박테리아를 분리하려면 약 3개의 멸균 1mm 비드, 웰당 20마이크로리터의 M9 버퍼가 있는 96웰 플레이트를 준비하고 세척된 단일 선충을 가능한 한 적은 액체로 각 웰에 피펫팅합니다. 비드 균질화기를 사용하기 전에 시연된 대로 선충류를 분해한 다음 플레이트를 짧게 원심분리하여 액체를 바닥으로 가져옵니다. 완료되면 현탁액을 수집하고 1에서 10 비율로 연속 희석합니다.
희석된 현탁액을 최대 100 마이크로리터의 플레이트를 9 센티미터 한천 플레이트에 플레이트합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 15도에서 20도에서 24-48 시간 동안 배양합니다. 순수한 박테리아 배양을 얻으려면 멸균 루프 또는 이쑤시개를 사용하여 배양된 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 정제 중에 사용된 것과 동일한 한천 배지가 포함된 새 한천 플레이트에 줄무늬를 그립니다.
플레이트의 1/3만 사용하십시오. 그런 다음 재사용 가능한 루프를 멸균하거나 새 멸균 루프를 사용하여 첫 번째 줄무늬를 통해 드래그하여 샘플 플레이트의 다른 1/3 부분에 두 번째 줄무늬를 만듭니다. 두 번째 줄무늬를 통해 루프를 드래그하고 세 번째 줄무늬를 만들어 단일 식민지 성장을 달성하여 반복합니다.
단리에 사용된 것과 동일한 성장 조건 하에서 플레이트를 배양하고, 필요하다면, 정제 단계를 반복한다. 동일한 온도 및 성장 조건을 사용하여 액체 배지에서 순수한 콜로니를 성장시킵니다. 다음으로, 순수 액체 배양에서 박테리아 DNA를 추출하여 27개의 정방향 및 1495개의 역방향 프라이머를 사용하여 16S 리보솜 RNA를 증폭하고 텍스트에 설명된 대로 PCR을 수행하여 박테리아를 특성화합니다.
수집 된 과일 및 퇴비 샘플을 페트리 접시에 분배하고 액체 또는 점성 배지에 담그면 벌레가 기질 재료를 떠나 배지 표면으로 헤엄 쳤습니다. 미생물은 순수한 단일 콜로니로 분리되었으며 일부 C.elegans 관련 박테리아가 생물막을 형성하거나 쉽게 응집되어 다종 배양을 초래할 수 있기 때문에 정제가 필수적인 역할을 했습니다. C.elegans 특이적 프라이머, 즉 NLP 30 정방향 및 NLP 30 역전을 사용한 PCR은 C.elegans에 대한 154 염기쌍 생성물의 증폭을 초래했습니다.
단일 웜에서 분리 된 DNA는 약한 PCR 밴드를 초래 한 반면, 최소 50 개의 웜으로 구성된 웜 집단에서 DNA를 추출하면 더 많은 양과 더 명확한 밴드가 생성되었습니다. C.elegans 특이적 PCR의 성공은 실험실 균주의 DNA인 N2를 양성 대조군으로 실행하여 미생물이 어디에나 있는 분리된 선충류의 DNA와 동시에 확인되었습니다. 따라서 분리 된 미생물이 자연의 벌레와 진정으로 연관되어 있는지 확인하기 위해 멸균 조건에서 작업하는 것이 필수적입니다.
분리된 미생물은 숙주-미생물군 상호작용 또는 숙주 생물학에서 미생물의 역할(예: 통제된 실험실 실험에서 노화, 발달 또는 면역)을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술로 분리 된 미생물은 현재 C.elegans 커뮤니티에서 숙주 적합성에 대한 미생물 다양성 또는 면역에 대한 미생물의 역할에 대한 이해를 향상시키는 데 사용됩니다.
