يسمح هذا البروتوكول برؤى جديدة حول الجراثيم الطبيعية ل C.elegans. في الوقت نفسه ، يمكن استخدام الميكروبات المعزولة في التجارب المعملية الخاضعة للرقابة لتوصيف تفاعلات مضيف الميكروبات وبيولوجيا C.elegans. يركز هذا البروتوكول على عزل الميكروبات المرتبطة ب C.elegans في الطبيعة ، والتي تعد بالتالي أساسية لفهم بيولوجيا هذا المضيف النموذجي المهم في سياق أكثر طبيعية.
سيكون من المفيد أن تكون على دراية بمظهر Caenorhabditis مقارنة بالديدان الخيطية الأخرى. قد يكون التقطيع تحت نطاق التشريح أمرا صعبا في البداية ، لكن الممارسة ستكون مفيدة. ابدأ بجمع العينات البيئية مثل السماد أو الفواكه الفاسدة في أكياس بلاستيكية منفصلة أو أنابيب أو حاويات نظيفة.
انشر قطع العينات البيئية المجمعة بالتساوي في طبق بتري معقم فارغ يبلغ طوله تسعة سنتيمترات وأضف ما يقرب من 20 ملليلتر من الوسط اللزج المعقم لتغطية العينة بالوسط. تحت مجهر التشريح ، ابحث عن نيماتودا Caenorhabditis باتباع الإرشادات الخاصة بعزل Caenorhabditis elegans والديدان الخيطية ذات الصلة. باستخدام ماصة من 20 إلى 100 ميكرولتر ، اجمع أصغر كمية ممكنة من السائل الذي يحتوي على نيماتودا Caenorhabditis من اللوحة وانقلها إلى طبق بتري الذي يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات والذي يحتوي على واحد إلى ثلاثة ملليلتر من M9T المعقم.
لإنشاء مجموعة من الديدان ، يمكن نقل الديدان الفردية إلى صفيحة ذات وسط نمو الديدان الخيطية أو NGM. لغسل الديدان الخيطية وإزالة الميكروبات الموجودة خارج الديدان الخيطية ، احتضنها في M9T لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ماصة من أصغر كمية ممكنة من السائل الذي يحتوي على الديدان الخيطية ونقلها إلى طبق بتري معقم جديد يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات يحتوي على واحد إلى ثلاثة ملليلتر من M9T الطازج.
لتحديد غير متحيز للميكروبات المرتبطة بالديدان الخيطية ، قم بإعداد 96 صفيحة بئر مع ما يقرب من ثلاث حبات معقمة بقطر ملليمتر واحد وأضف خليطا من 19.5 ميكرولتر من محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل و 0.5 ميكرولتر من البروتيناز K لكل بئر. انقل نيماتودا واحدة مغسولة إلى كل بئر بأقل قدر ممكن من السوائل. قم بتفكيك الديدان الخيطية المنقولة باستخدام خالط حبة لمدة ثلاث دقائق عند 30 هرتز وطرد مركزي للألواح أو الأنابيب عند 8،000 G لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة للحصول على السائل إلى القاع.
لتحديد C.elegans ، قم بتسخين العينات في دورة PCR لمدة ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية و 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية لعزل الحمض النووي للديدان الخيطية الفردية ، أو استخدم مجموعات تجارية لعزل الحمض النووي لمجموعات الديدان. قم بتجميد الحمض النووي المعزول عند 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل. استخدم الحمض النووي وزوج التمهيدي NLP 30 للأمام و NLP 30 للخلف وإنتاج منتج PCR زوج أساسي 154.
لعزل البكتيريا ، قم بإعداد صفيحة من 96 بئرا مع ما يقرب من ثلاث حبات معقمة ملليمتر واحد ، و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 لكل بئر ، وماصة نيماتودا واحدة مغسولة لكل بئر بأقل قدر ممكن من السوائل. قم بتفتيت الديدان الخيطية كما هو موضح قبل استخدام خالط الخرز ، متبوعا بطرد مركزي قصير للوحة لإيصال السائل إلى القاع. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اجمع التعليق وقم بتخفيفه بشكل متسلسل بنسبة واحد إلى 10.
لوحة ما يصل إلى 100 ميكرولتر من التعليق المخفف على لوحات أجار تسعة سنتيمترات. ثم احتضان الألواح عند 15 إلى 20 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. للحصول على الثقافة البكتيرية النقية ، اختر مستعمرة واحدة من الصفيحة المحتضنة باستخدام حلقة معقمة أو عود أسنان وقم بخطها على صفيحة أجار جديدة تحتوي على نفس وسط الآجار المستخدم أثناء التنقية.
تأكد من استخدام 1/3 من اللوحة فقط. ثم قم بتعقيم حلقة قابلة لإعادة الاستخدام أو استخدم حلقة معقمة جديدة واسحبها عبر الخط الأول لإنشاء خط ثان على جزء آخر من لوحة العينة. كرر ذلك عن طريق سحب حلقة عبر الخط الثاني وإنشاء الخط الثالث لتحقيق نمو مستعمرة واحدة.
احتضان اللوحة تحت نفس ظروف النمو المستخدمة للعزل ، وإذا لزم الأمر ، كرر خطوة التنقية. تنمو المستعمرات النقية في وسط سائل باستخدام نفس درجة الحرارة وظروف النمو. بعد ذلك ، قم بتوصيف البكتيريا عن طريق استخراج الحمض النووي البكتيري من الثقافات السائلة النقية التي تضخم الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S باستخدام 27 بادئا أماميا و 1495 بادئا عكسيا وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في النص.
عندما تم توزيع عينات الفاكهة والسماد التي تم جمعها في أطباق بتري وغمرها في وسط سائل أو لزج ، أدى ذلك إلى مغادرة الديدان لمادة الركيزة والسباحة إلى سطح الوسط. تم عزل الميكروبات كمستعمرات مفردة نقية ولعبت التنقية دورا أساسيا حيث يمكن لبعض البكتيريا المرتبطة ب C.elegans تشكيل أغشية حيوية أو تجميعها بسهولة ، مما أدى إلى مزارع متعددة الأنواع. أدى تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الخاصة ب C.elegans ، وهي NLP 30 إلى الأمام و NLP 30 للخلف ، إلى تضخيم منتج زوج أساسي 154 ل C.elegans.
أدى الحمض النووي المعزول من الديدان المفردة إلى ضعف نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، في حين أن استخراج الحمض النووي من مجموعات الديدان التي تتكون من 50 دودة على الأقل أسفر عن كمية أكبر ونطاقات أكثر وضوحا. تم تأكيد نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص ب C.elegans من خلال تشغيل الحمض النووي لسلالة معملية وهي N2 كعنصر تحكم إيجابي في وقت واحد مع الحمض النووي للديدان الخيطية المعزولة الميكروبات في كل مكان. وبالتالي ، من الضروري العمل في ظل ظروف معقمة للتأكد من أن تلك الميكروبات المعزولة مرتبطة حقا بالدودة في الطبيعة.
يمكن استخدام الميكروبات المعزولة لدراسة تفاعلات الميكروبات المضيفة أو دور الميكروبات في بيولوجيا المضيف ، على سبيل المثال ، الشيخوخة أو التطور أو المناعة في التجارب المعملية الخاضعة للرقابة. يتم استخدام الميكروبات المعزولة بهذه التقنية حاليا من قبل مجتمع C.elegans لتحسين فهم تنوع الميكروبات على لياقة المضيف أو دور الميكروبات في المناعة.
