Этот протокол позволяет по-новому взглянуть на естественную микробиоту C.elegans. Одновременно изолированные микробы могут быть использованы в контролируемых лабораторных экспериментах для характеристики взаимодействий микробиоты и хозяина и биологии C.elegans. Этот протокол фокусируется на выделении микробов, связанных с C.elegans в природе, которые, следовательно, являются ключевыми для понимания биологии этого важного хозяина модели в более естественном контексте.
Будет полезно ознакомиться с внешним видом caenorhabditis по сравнению с другими нематодами. Пипетка под областью препарирования изначально может быть сложной задачей, но практика будет полезна. Начните с сбора образцов окружающей среды, таких как компост или гнилые фрукты, в отдельные пластиковые пакеты, трубки или чистые контейнеры.
Равномерно распределите кусочки собранных образцов окружающей среды в стерильной девятисантиметровой пустой чашке Петри и добавьте примерно 20 миллилитров стерильной вязкой среды, чтобы покрыть образец средой. Под рассекающим микроскопом ищите нематод Caenorhabditis в соответствии с рекомендациями по выделению Caenorhabditis elegans и родственных нематод. Используя пипетку от 20 до 100 микролитров, соберите с пластины минимально возможное количество жидкости, содержащей нематоды Caenorhabditis, и переложите ее в трехсантиметровую чашку Петри, содержащую от одного до трех миллилитров стерильного M9T.
Чтобы установить популяцию червей, отдельные черви могут быть перенесены на пластину со средой роста нематоды или NGM. Чтобы промыть нематод и удалить микробы, присутствующие за пределами нематод, инкубируйте их в M9T в течение 10-15 минут. Выбрасывайте наименьшее возможное количество жидкости, содержащей нематод, и перекладывайте ее в новую стерильную трехсантиметровую чашку Петри, содержащую от одного до трех миллилитров свежего M9T.
Для объективной идентификации нематод-ассоциированных микробов подготовьте 96 луночных пластин с примерно тремя стерильными шариками диаметром один миллиметр и добавьте смесь из 19,5 микролитров буфера ПЦР и 0,5 микролитра протеиназы К на лунку. Переложите одну промытую нематоду в каждую лунку с как можно меньшим количеством жидкости. Разбейте перенесенных нематод с помощью гомогенизатора шариков в течение трех минут при 30 герцах и центрифугируйте пластины или трубки при 8 000 G в течение 10 секунд при комнатной температуре, чтобы получить жидкость на дно.
Чтобы идентифицировать C.elegans, нагревайте образцы в цикле ПЦР в течение одного часа при 50 градусах Цельсия и 15 минут при 95 градусах Цельсия, чтобы изолировать ДНК отдельных нематод, или используйте коммерческие наборы для выделения ДНК популяций червей. Заморозьте изолированную ДНК при минус 20 градусах Цельсия для длительного хранения. Используйте ДНК и праймерную пару NLP 30 вперед и NLP 30 обратно и получите ПЦР-продукт 154 пары оснований.
Чтобы изолировать бактерии, подготовьте 96-луночную пластину с примерно тремя стерильными шариками в один миллиметр, 20 микролитрами буфера M9 на лунку и пипеткой одной промытой нематоды в каждую лунку с как можно меньшим количеством жидкости. Разбейте нематоды, как показано перед использованием гомогенизатора шариков, с последующим коротким центрифугированием пластины, чтобы доставить жидкость на дно. После этого соберите суспензию и последовательно разбавьте ее в пропорции от одного до 10.
Нанесите до 100 микролитров разбавленной суспензии на девятисантиметровые агаровые пластины. Затем инкубируют пластины при температуре от 15 до 20 градусов Цельсия в течение 24-48 часов. Чтобы получить чистую бактериальную культуру, выберите одну колонию из инкубированной пластины с помощью стерильной петли или зубочистки и нанесите ее на новую агаровую пластину, содержащую ту же агаровую среду, которая использовалась во время очистки.
Убедитесь, что используется только 1/3 пластины. Затем стерилизуйте многоразовую петлю или используйте новую стерильную петлю и перетащите ее через первую полосу, чтобы создать вторую полосу на другой 1/3 части пластины образца. Повторите это, протащив петлю через вторую полосу и создав третью полосу, чтобы достичь роста одной колонии.
Инкубируют пластину в тех же условиях роста, которые используются для изоляции, и при необходимости повторяют стадию очистки. Выращивайте чистые колонии в жидкой среде, используя те же температуры и условия роста. Затем охарактеризуйте бактерии, экстрагируя бактериальную ДНК из чистых жидких культур, амплифицируя рибосомальную РНК 16S с использованием 27 прямых и 1495 обратных праймеров и выполняя ПЦР, как описано в тексте.
Когда собранные образцы фруктов и компоста были распределены в чашках Петри и погружены в жидкую или вязкую среду, это привело к тому, что черви покидали материал субстрата и плавали на поверхности среды. Микробы были выделены как чистые одиночные колонии, и очистка сыграла важную роль, поскольку некоторые бактерии, связанные с C.elegans, могут образовывать биопленки или легко агрегироваться, что приводит к многовидовым культурам. ПЦР с использованием специфических праймеров C.elegans, а именно NLP 30 вперед и NLP 30 реверса, привела к усилению продукта 154 пары оснований для C.elegans.
ДНК, выделенная из одиночных червей, привела к слабым полосам ПЦР, тогда как извлечение ДНК из популяций червей, состоящих по меньшей мере из 50 червей, дало большее количество и более четкие полосы. Успех специфической ПЦР C.elegans был подтвержден запуском ДНК лабораторного штамма, а именно N2, в качестве положительного контроля одновременно с ДНК изолированных нематод Микробы повсюду. Следовательно, важно работать в стерильных условиях, чтобы гарантировать, что те микробы, которые изолированы, действительно связаны с червем в природе.
Изолированные микробы могут быть использованы для изучения взаимодействия хозяина и микробиоты или роли микробов в биологии хозяина, например, старения, развития или иммунитета в контролируемых лабораторных экспериментах. Микробы, выделенные с помощью этого метода, в настоящее время используются сообществом C.elegans для улучшения понимания разнообразия микробиоты по приспособленности хозяина или роли микробов в иммунитете.
