マウス糞便分離と微生物叢移植

ここでは、糞便サンプルの収集からスイスロール法を使用した腸の変化の研究まで、病気の嚥下障害のメカニズムを調査する際に他の人を導くためのプロトコルについて説明しました。まず、安楽死させたマウスの胸部と側面に70%エタノールをスプレーし、皮膚と腹腔を慎重に開いて胃腸管を露出させます。盲腸を分離し、滅菌外科用ハサミを使用して半分に切ります。

盲腸を短時間露出させ、回腸から近位に0.5センチメートル、結腸との接合部で遠位に0.5センチメートルを切ります。分離した盲腸を滅菌ペトリ皿に移します。滅菌ヘラを使用して盲腸内容物を滅菌チューブに移し、アリコートを摂氏80度の冷凍庫に保管します。

新鮮なまたは以前に凍結した糞便ペレットを滅菌生理食塩水に1〜20の割合で再懸濁し、均質になるまでボルテックスします。.ホモジネートを30マイクロメートルの細孔のナイロンフィルターに通して、大きな粒子状物質を除去します。79Gで5分間遠心分離し、移植に使用する上清を回収した。

無菌レシピエントマウスあたりスラリー100マイクロリットルを3日間連続して経口強制投与し、続いて2週間にわたって3日毎に経管投与を行った。予熱したマウスホルダーの拘束具にマウスをそっと置き、尾を外側に残します。マウスにストレスを与えないように、上部をつままずかずに慎重にテープで留めます。

マウスをホルダーに入れ、シートで覆われたテールカフマシンのプラットフォームに3〜5分間置きます。テールカフプレチスモグラフィーを使用して少なくとも3ラウンドの収縮期血圧測定値を収集し、すべてのラウンドの測定値を平均して、各動物の平均収縮期血圧を測定します。安楽死させたマウスから盲腸内容物を無菌的に採取する。

腸やその他の組織を採取するには、マウス内の組織を見つけ、ハサミで切除して、心血管代謝の健康における腸内細菌叢の役割を調べます。初日に、マウスの腸を肛門側から胃側に解剖します。そして単離した胃腸管全体をPBSを含むシャーレに入れる。

近位端を胃の端からそっと引っ張り、周囲の脂肪と結合組織を手で取り除きます。小腸を隔離し、それぞれの長さでZ型ジグザグを作ります。その後、切断して十二指腸、空腸、回腸を得る。

盲腸の下の腸の部分を切断することによって結腸を隔離します。十二指腸、空腸、回腸、結腸を切断します。注射器とボール先端の針を使用して、腸を引き裂くことなくPBSで腸内を注意深く洗い流して洗浄します。

腸をろ紙の上に置き、セクションの名前で紙にラベルを付け、次に左上隅にPを近位に、Dを左下隅に遠位にラベルを付けます。ボールチップハサミで腸を縦に切ります。ろ紙の腸を開き、必要に応じてさらにPBSで洗浄します。

腸を2つのろ紙の間に挟み、腸の近くの4つのポイントまたは角でろ紙をホチキス止めします。10%ホルマリン中性緩衝液に浸し、プラットフォームロッカーを用いて室温で一晩5rpmで振とうする。2日目に、調製した2%アガロースを蒸留水中で、アルミホイルで覆われたビーカーで攪拌子で加熱します。

組織を回収するには、上部のろ紙を剥がし、近位側が最初に内側に入るように近位側から腸を転がし、スライド上で内腔も内側になるように内側に転がします。必要に応じて、30ゲージの針または2本でピン留めします。使い捨てのグラデュアルトランスファーピペットを使用して1ミリリットルのアガロースを吸引し、組織内の気泡を避けながら、平らな面の転がされた腸切片にアガロースを注ぎます。

アガロースが冷えて固まったら、かみそりの刃を使用して、組織切片の周りの余分なアガロースをトリミングします。最後に、腸切片を組織処理または埋め込みカセットに入れ、摂氏4度の70%エタノールに浸します。ここでは、通常の塩食と高塩分食のマウスから得られた盲腸含有量の種の生物多様性の推定を示します。

高塩分に反応した腸内細菌叢の変化には、細菌の生物多様性の減少が含まれていました。非メトリック多次元尺度法は、通常の塩分マウスと高塩分食マウスの細菌が別々のクラスターを形成することを示しています。高塩は、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率の増加に関連しています。

高塩分給餌マウスからの糞便微生物叢移植は、無菌マウスをアンジオテンシンII誘発高血圧にかかりやすくします。高塩分誘発性腸内細菌叢の移植は、正常な塩分腸内細菌叢を投与されたマウスと比較して、無菌マウスの収縮期血圧の有意な上昇と関連していた。代表的な画像は、タンパク尿の有無にかかわらず高脂血症を有するマウスから得られた腸骨におけるアポリポタンパク質A-I染色を示す。

このプロトコルは、ヒトとげっ歯類の両方のドナーに対する重要な実験的考慮事項においてFMTを成功させるためのステップを調整します。