The authors would like to acknowledge the Infectious Disease Department at Brigham and Women&#8217;s Hospital especially Michael S. Calderwood, MD, MPH for helping us construct this protocol. We would also like to thank the Institution&#8217;s endoscopy center and it&#8217;s leadership team for their support.

注：この原稿出版時点で治験薬（IND）アプリケーションは、臨床現場で再発CDIのためのFMTを行う必要がない。 FMTから、研究の一部として、または別の適応症のために行われている場合は、INDまたは同等のアプリケーション18を必要とすることができる。規制当局は、おそらくCDIと他の病状に適用されるFMTの安全性と有効性を評価していきますので、それに先立っFMTプログラムの開始と一回二ヶ月に一人一人にあなたのそれぞれの位置に規制要件を確認することをお勧めします積極的にFMTを行う。 注候補は糞便移植だけでなく、大腸内視鏡検査に同意するものとして喜んでなければなりません。 FMTのための適切な候補の1の識別<ol><li>従来の抗生物質に反応しない再発性CDIまたは難治性疾患の患者を持っている患者はappropriatですFMTの電子候補。 注：再発性CDIは毒素検査やPCRによって確認CDIの3以上のエピソード、または入院を必要とされる2つのエピソードの歴史として定義されている。 </li><li>患者が安全に大腸内視鏡検査を受けることができることを確認してください。これは、内視鏡医の裁量である。 </li></ol> 2.スツールのドナー選択 NOTE：スツールドナーの選択はCDIの治療に適用され、他の障害の治療に適用できないかもしれない。 <ol><li>患者がドナーを識別し確認してください。潜在的なドナーは、最初の消化器クリニック訪問時の受信者に存在すべきである。ドナーは配偶者、家族、または友人かもしれません。ドナーは限り他の基準が満たされている受信者と同じ居住地に住んでいることがあります。 </li></ol> 3.ドナー適格性<ol><li>参加基準：ドナーは（≥18歳）健康な成人で、毎日の形成された腸メートルを持っていることを確認してくださいovement。 </li><li>除外基準： <ol><li>ドナーが抗生物質を服用されていないか、または過去3カ月または感染のための任意の薬で抗生物質を取っていないことを確認してください。 </li><li>ドナーは便秘の歴史を持っているか、慢性的に下剤を使用していないことを確認してください。さらに、炎症性腸疾患、慢性下痢、顕微鏡的大腸炎、腸/結腸悪性腫瘍、または胃バイパス/他の減量手術の歴史の個人史の歴史を持っていないドナーを確保する。 </li><li>感染性下痢が懸念される地域へのドナー最近（最後の3カ月以内）旅していないことを確認してください。彼らが旅して下痢を経験している場合、それらはexludedする必要があります。 </li><li>ドナーはどんな免疫抑制剤を服用していないし、全身化学療法ではないされていることを確認。 </li><li>ドナーはメタボリック症候群、自己免疫状態またはアトピー性疾患を持っていないことを確認してください。 </li></ol></li><li>書かれた詐欺を取得前のスクリーニング検査の敏感な性質を与えられたスクリーニングにドナーとレシピエントから送られた。テスト結果は、相手と共有されることはありません両当事者を安心させる。 </li></ol> 4.スクリーニング注：このスクリーニングプロトコルは、ブリガムとマサチューセッツの女性の病院で患者に適応した、米国の前に、すべての適切なスクリーニング試験が検討されていることを確認するFMTプロトコルを開始する疾患部門と病院の感染対策感染コンサルティング考えてみましょう。 <ol><li>受信者： <ol><li>初期診療所の訪問の際には、受信者のスクリーニングのために、以下の臨床検査を送信（これらの感染症のためのベースラインテストを確立し、将来的には、送信の疑いがないことを確認するため）。 </li><li>肝炎A（IgGおよびIgM）、B型肝炎（HbsAgの/ AbおよびHbcAb）、C型肝炎抗体、HIV-1/2（Abおよびウイルス量）および梅毒（TP-IgG）を実験室血液tを行うESTは。 </li><li>この初期評価で、食物アレルギーの徹底した歴史を取得します。 </li></ol></li><li>ドナー： <ol><li>成形されたスツールが廃棄されていないことを確認するためのスクリーニング前に、微生物学研究室と調整。 </li><li>ドナー部3に従って適格基準を満たしている場合、ドナースクリーニングのために、以下の臨床検査を注文。 </li><li> A型肝炎（IgGおよびIgM）、B型肝炎（HBs抗原/ AbおよびHBcAb）、C型肝炎抗体、HIV-1/2（Abおよびウイルス量）と梅毒（TP-IgG）の実験室血液検査を行います。 </li><li> （培養による）C.ディフィシル 、ルーチン便の文化、ジアルジア抗原、クリプトスポリジウム抗原と卵子や寄生虫の研究室スツールテストを実行します。 </li><li>以上30日ドナーを選別するが、好ましくは1から2週間前にスケジュールの手順と。 注：ドナーが下痢や液状便を開発した場合、彼らは寄付の対象とはなりません長い。 </li></ol></li><li>顧問に基づいて回避する食品に関するドナー受信者の食物アレルギー。ドナーは、受信者が寄付する前に5日間アレルギーされた食品を摂取するべきではありません。 </li></ol> 5.事前手続きの準備<ol><li>受信者： <ol><li>受信者が経口バンコマイシン入っていない場合は、最初の来院時に、手続きの前に少なくとも7〜10日ごとに6時間は125 mgのバンコマイシン開始。 </li><li>スケジュールされた手順の前日に行われるための前大腸内視鏡検査腸の準備のための内視鏡検査センターの指示を受信者を提供します。受信者はまた、処置の前の週のための内視鏡検査センターの標準食餌の指示に従ってください。 </li><li>手続きの前に夜バンコマイシンの彼らの最後の投与量を取るために、受信者に指示します。 </li></ol></li><li>ドナー： <ol><li>いくつかの糞便採取カップを持つドナーを提供します。ラベルトイレインサート（帽子）やカップ受信者のラベルが付いただけでなく、3空のspecimenコンテナ。前（手続きの時間）を処理する6時間を超えない糞便の収集を開始するためにドナーを依頼。 注：ドナーは、複数の便検体を提供している場合、彼らは日付と時刻で標識する必要があります。新鮮なサンプルを使用します（1満たされた試料カップは十分であろう）。 </li><li>受信者がプロシージャに彼らとドナーの便試料をもたらしていることを確認します。 </li><li>室温で糞便サンプルを保管してください。すべての軟便を除外します。下水システム内の任意の未使用のスツールを破棄（研究目的のために保存しない限り）。 </li></ol></li></ol> 6.スツール準備注：この手順は、病院の感染管理部門で審議され、承認されていることを確認。 <ol><li>スツールを準備する際、個人用保護具を着用する。 </li><li> othの汚染を防止する18インチスプラッシュゾーンが存在している指定された作業領域内視鏡検査室で糞便を準備小胞体材料。 </li><li>病院が承認した消毒剤と指定された領域をきれいに、準備をスツールの前に。 </li><li>汚染を避けるために、使い捨てパッドで領域を覆う。 </li><li> 14オンスシングルスピードブレンダーに形成された糞便を移し、通常の生理食塩水の500 ccのを追加します。 </li><li>少なくとも1分間、または、液体、スラリーコンシステンシーに達するまで内容物を混合する。ブレンダーの蓋を除去するときにこぼれないように注意してください。 </li><li>任意の固体廃棄物を排除するためにプラスチック製の8クォート盆地にストレーナーを通して溶液を注ぐ。ストレーナーを捨てる。 </li><li> （大腸内視鏡検査によって標準FMTのために約8〜9）を60ccのルアーロックシリンジに緊張したソリューションを策定する。ほてりのための通常の生理食塩水の余分な60のccを策定する。 </li></ol>大腸内視鏡検査を経由7.糞便移植<ol><li>実行またはinfusioを支援しながら、内視鏡検査ユニット方針に従って個人用保護具を着用N。 </li><li>可能な場合は、患者が処置後にスツールを保持に協力することが可能となるよう、光鎮静を考えてみましょう。 </li><li>回腸末端に大腸内視鏡検査を行います（または限り技術的に可能）。 colonscope、洗浄、吸引、残留液状便の挿入時に。 </li><li>炎症の証拠のための粘膜の壁を点検したが、粘膜生検を定期的にFMT手順の間に実行されません。 注：完全な大腸内視鏡検査による炎症の程度に安全であるかどうかを決定します。そうでない場合は、点滴とのより限定軟性S状結腸鏡検査（糞便スラリーの半分を使用）を検討してください。 </li><li>延長チューブとの生検チャネルキャップを使用して結腸鏡の生検チャネルを介して一度回腸末端に60 CC（1注射器）を注入する。 </li><li>スツールシリンジのアプリケーション間の、目詰まりを避けるために、通常の生理食塩水でチャンネルをフラッシュする。 </li><li>盲腸にスツールの他の60のccを注入し、右Cで繰り返すOLON。 </li><li>半ば横行結腸に到達するまで均等にすべての4つの結腸壁の象限にスラリーを配布しながら、すべての5〜10センチメートル30 CCを注入続行。便の注射器の間に生理食塩水で洗い流すことを忘れないでください。 注：スラリーの粘性が高い場合は、注射器にかなりの力でプッシュする必要があるかもしれない。生検チャネルキャップは大腸内視鏡から分離し、糞便内容の流出を生じさせないように注意してください。頻繁な洗浄は、スラリーのより容易に通過を可能にします。スラリーを押しての継続的な難しさがある場合は、二度目の残りのドナースツールを再緊張または生理食塩水でさらに希釈することを検討してください。 </li><li>任意の液体スツールを吸引しないように注意しながら、シリンジバレルを変更する際に撤退の際に過剰空気を吸引。 注：患者は便失禁を知っていた場合は、最後の注射器は、肝湾曲よりも低い時のリークとPOST手順を避けるためないように注入されるべきである。 </li><li>第一回FMTとのE大腸内視鏡検査が完了する限り、彼らができるように糞便を保持するために患者に助言する。彼らは、大腸内視鏡検査が完了した2時間後に彼らの通常の食事や薬を再開することができる。 </li></ol> FMTクリーンアップ8.大腸内視鏡検査<ol><li>病院のプロトコールに従ってポスト手続き機器再処理、環境洗浄/消毒と廃棄物処理を実行します。 </li><li>適切なバイオハザードコンテナ内のすべての糞便材料廃棄してください。 </li><li>標準プロトコルごとのルーチンの処理のために除染エリアに結腸内視鏡を持参。 </li><li>他の汚れた廃棄物と一緒にブレンダーとストレーナ廃棄してください。 注：シングルユースブレンダーとストレーナメソッド各混合機関交互に実行可能ではない場合が考えられる。一つの例：オートクレーブ内でクリーニングすることができるステンレス製のポテトライサーを通じてスツールを渡す。私たちはあなたの施設の感染制御DEPを持つ任意の潜在的な方法を議論することをお勧めしますartment。 </li><li>施設が承認した製品を使用してプロシージャのために使用されたすべての表面を除染。 </li></ol> 9.フォローアップ<ol><li>約30日FMT後の患者のための消化器クリニックでフォローアップの予定を配置します。 </li><li>カウンセル抗生物質の将来のコースを持つC.ディフィシル再発のリスクについて患者。 </li></ol>有害事象の10のレポート<ol><li> FMTは、安全な手順であると考えられているが、それは強く、すべての有害事象を追跡することをお勧めします手順と関連していることが感じたと適切な規制のボードに報告する。 </li><li> FMTの長期安全性を文書化するために、定期的に照会することができる信頼性のあるデータベースを保持。 </li></ol>

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S., Khoruts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+preparing+an+investigational+new+drug+application+for+fecal+microbiota+transplantation+studies.">Guidance on preparing an investigational new drug application for fecal microbiota transplantation studies.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 283-288 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose relevant to the material presented in this manuscript.

糞便移植は再発CDI有効かつ安全な治療法であることが示されている。私たちは、大腸内視鏡検査を経由して 、FMTための標準プロトコルの概要を説明し、再発性CDIのための手順を受けた22人の患者のための当社の業績が含まれている。我々の結果は、これまで1ヶ月後のFMTを繰り返しだけ一人の患者に再発性疾患のために公表されたデータに匹敵する。手順の重要なステップは、ドナーが...

pseumembranous大腸炎の治療のための糞便移植が最初に1958年に記載された1。しかし、バックには早く四世紀中国2などの食中毒と重度の下痢日の治療のための糞便を摂取するとの報告。糞便微生物移植（FMT）は、文献にも呼ばれている「糞便細菌療法」、「ヒトプロバイオ注入」、「糞便移植」、「腸のmicrobiome修復」、および「糞便転送」。それは健康、事前スクリーニングドナーから糞便を収集し、経鼻胃管、esophagogastricduodenoscopy、大腸内視鏡検査、または浣腸3を介して受信者の消化管に調製したスラリーを提供することを含む。多くの症例は、しかし、より最近の研究では、大腸内視鏡検査を介してドナー糞便の投与が安全で4非常に有効であることが示されている、NGT及び浣腸を介して投与の有効性を報告している。そのような経鼻胃管投与などの他の方法が報告されているが、大腸内視鏡を介してドナー糞便の送達は、以下の即時副作用（ 例えば腹部膨満および悪心）4を有しており、我々はそれをすることによって行われるとき、患者は、よりFMTの概念を受け入れていることを見出した大腸内視鏡検査。大腸内視鏡検査を介して、FMTの治療上の利点の一つは、前の手順4に行われる腸洗浄液に結腸バイオマスの減少である。 複数の研究は、日和見病原体によって引き起こさC.大腸炎及び下痢の治療のためのFMTの役割を検討したディフィシル （CDI）。 CDIの発生率は上昇し続け、世界中で大きな経済的負担、罹患率および死亡率の主要な原因である。 CDIのための第一選択治療は抗生物質治療で構成されて、しかし、再発率は15から35% 5との間で報告されている。いくつかのケースシリーズとの報告を行う必要が抗生物質4,6-16に標準医療にCDIの耐火用FMTの安全性と有効性をcumented。 CDIのための大腸内視鏡検査を経由してFMT後の患者の長期的なフォローアップを見て研究では、77人の患者17で91パーセントの一次治癒率を報告した。 私たちのセンター（消化器、肝臓や内視鏡検査のブリガム·アンド·ウィメンズ病院課）で、我々は再発性または難治性のCDIの患者のための糞便移植プログラムを開始した。適切な候補は、従来の抗生物質に反応しない難治性疾患の再発性のCDI（入院を必要とした3つ以上のエピソード、または2エピソードの歴史）、または患者を有する患者と定義されている。私たちは、この手順のすべての段階に体系的なアプローチが有効性を最大化すると考えています。この原稿とそれに付随するビデオでは、我々詳細我々は、患者とドナーのスクリーニング、スツールの準備が含まれて私たちのセンター、で採用しているプロトコル、および糞便aの配信大腸内視鏡検査の時間をトン。この方法は、公表された文献に匹敵する肯定的な結果をもたらした。 症例提示： この患者は、糞便移植のために呼ばれる典型的な患者を表します。 患者は、化学療法とのさらなる治療を要する疾患の再発を持っていた慢性リンパ性白血病の歴史を持つ69歳の女性です。彼女は昨年のCDIの3つのエピソードに苦しんで、そのために再起動する化学療法に先立ってFMTの検討のために私たちのクリニックに紹介された。 CDIの彼女の最初のエピソードは彼女がいずれかの抗生物質がなかった2012年10月に発生した。彼女は、敗血症性ショックを呈した後、ICUで非常に病気だったと順行性が彼女の病気の重症度与えられた経口バンコマイシンとの組み合わせで6週間のコースのために浣腸をバンコマイシンとループ回腸を流用受けた。彼女は下痢の分解能で非常によくやったと彼女は来ることができました抗生物質オフ。それが逆転したので、彼女は彼女のストーマの周りにヘルニアを開発しました。まもなくオストミー逆転した後、彼女は再び下痢を開発し、Cであるために再び発見されたディフィシル毒素ポジティブ。彼女は、経口バンコマイシンの別の6週間のコースを完了し、正常にの先細りすることができました。しかし、数か月後に、彼女は再びであった下痢を開発ディフィシル毒素陽性および経口バンコマイシンの彼女の第三のコースを開始した。それは彼女の白いカウントが&gt; 100に上昇させ、彼女は骨髄生検の彼女のCLLの再発を有することが判明したことが注目されたとき、彼女は抗生物質でよくやっていた。彼女の腫瘍医は彼女のCDIの完全な解像度ずに化学療法を開始することを懸念したので、我々はFMTを実行するように求めていた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:247px;">Blender</td>
			<td style="width:121px;">Hamilton Beach</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:355px;">http://www.amazon.com/Hamilton-Beach-51101-Personal-Blender/dp/B00065L6CU/ref=pd_sim_k_2?ie=UTF8&#38;refRID=1Q06MXAE9XKTB4QG0AEN</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:247px;">Strainer</td>
			<td style="width:121px;">Winco MS3A-8S Strainer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:355px;">http://www.amazon.com/Winco-MS3A-8S-Strainer-Single-Wooden/dp/B001VZ5E40/ref=sr_1_3?s=home-garden&#38;ie=UTF8&#38;qid=1395001295&#38;sr=1-3&#38;keywords=kitchen+strainer+wooden+handle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Disposable pads (chux), 17in x 24in.&#160;</td>
			<td>hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>one package&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Pink rectangular hospital standard wash basin, 8 quart&#160;</td>
			<td>hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1 or 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">500 cc bottle of sterile normal saline</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">60cc leur lock syringes</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 or 9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Biopsy channel cap with extension</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal microbiota transplantation via colonoscopy for recurrent c. difficile infection

糞便細菌叢移植（FMT）再発性および難治性のC.のための安全で効果の高い治療法であるディフィシル感染症（CDI）。 FMT投与の様々な方法が経鼻胃管、上部内視鏡検査、浣腸、および大腸内視鏡検査などの文献に報告されている。 FMT大腸内視鏡検査の収量を経由して優れた治癒率とも良好な耐容性である。我々は、患者がこの送達に許容可能かつ許容モードを見つけることを見出した。私たちのセンターでは、再発性または難治性のCDIの患者のための糞便移植プログラムを開始した。私たちは、改訂の反復プロセスを使用してプロトコルを開発してきたし、現在発表された文献に匹敵する成功率を持つ22人の患者に24糞便移植を行った。患者とドナースクリーニング、スツールの準備、および便の配達への体系的なアプローチは、治療の成功を最大化します。ここでは詳細任意の内視鏡検査で行うことができるFMTプロトコルの各ステップを安全と成功度の高いセンター。

我々は、上記のプロトコルを使用して、我々のセンター（ 表1）で22人の患者に24 FMTからを行った。ナインの患者が同時IBD（クローン病と6と潰瘍性大腸炎の3）を有していた。全9は、CDIの解像度を持っていた。クローン病患者の一つは、状態が、クローン病、大腸炎の合計結腸切除を投稿した。彼は当初、しかし、彼はCDIの解像度が得られた上部消化管内視鏡検査を介して第二のF...

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Fecal Microbiota Transplantation via Colonoscopy for Recurrent C. difficile Infection

大腸内視鏡検査を介した糞便細菌叢移植は再発性および難治性C。ディフィシル感染症のための安全で効果的な治療法である。大腸内視鏡検査中に患者とドナースクリーニング、スツールの準備、および便の配達への体系的なアプローチは、治療の成功を最大化します。

再発のための大腸内視鏡検査を経由して糞便細菌叢移植<em&gt; C。ディフィシル</em&gt;感染

Fecal Microbiota Transplantation (FMT) is a safe and highly effective treatment for recurrent and refractory C. difficile infection (CDI). Various methods ...

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Research

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Medicine

Fecal Microbiota Transplantation via Colonoscopy for Recurrent C. difficile Infection

27.0K ビュー.  Brigham and Women‘s Hospital. 大腸内視鏡検査を介した糞便細菌叢移植は再発性および難治性C。ディフィシル感染症のための安全で効果的な治療法である。大腸内視鏡検査中に患者とドナースクリーニング、スツールの準備、および便の配達への体系的なアプローチは、治療の成功を最大化します。 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

医学

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

腫瘍溶解性ウイルスと生きている組織のex vivoでの感染

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

筋萎縮性側索硬化症や外傷性脊髄損傷では頚椎前角をターゲットとするための髄腔内細胞移植

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Small bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with short gut syndrome and failure of parenteral nutrition (irreversible intestinal failure). In specialized centers improved operative and managing strategies have led to excellent short- and intermediate term patient and graft survival while providing high quality of life 1,3. Unlike in the more common transplantation of other solid organs (i.e. heart, liver) many underlying mechanisms of graft function and immunologic alterations induced by intestinal transplantation are not entirely known6,7. Episodes of acute rejection, sepsis and chronic graft failure are the main obstacles still contributing to less favorable long term outcome and hindering a more widespread employment of the procedure despite a growing number of patients on home parenteral nutrition who would potentially benefit from such a transplant. The small intestine contains a large number of passenger leucocytes commonly referred to as part of the gut associated lymphoid system (GALT) this being part of the reason for the high immunogenity of the intestinal graft. The presence and close proximity of many commensals and pathogens in the gut explains the severity of sepsis episodes once graft mucosal integrity is compromised (for example by rejection). To advance the field of intestinal- and multiorgan transplantation more data generated from reliable and feasible animal models is needed. The model provided herein combines both reliability and feasibility once established in a standardized manner and can provide valuable insight in the underlying complex molecular, cellular and functional mechanisms that are triggered by intestinal transplantation. We have successfully used and refined the described procedure over more than 5 years in our laboratory 8-11. The JoVE video-based format is especially useful to demonstrate the complex procedure and avoid initial pitfalls for groups planning to establish an orthotopic rodent model investigating intestinal transplantation.

Small bowel transplantation has become an accepted treatment option for patients with irreversible intestinal failure. Our experimental model of orthotopic small bowel transplantation in rats serves as a reliable tool to address underlying immunologic and inflammatory processes that complicate intestinal transplantation.

ラット同所性小腸移植

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove nonadherent cells and lung lining fluid from the mucosal surface. In research environments, BAL allows sampling of innate (lung macrophage), cellular (B- and T- cells), and humoral (immunoglobulin) responses within the lung.
BAL is internationally accepted for research purposes and since 1999 the technique has been performed in &#62; 1,000 subjects in the UK and Malawi by our group.
Our technique uses gentle hand-held suction of instilled fluid; this is designed to maximize BAL volume returned and apply minimum shear force on ciliated epithelia in order to preserve the structure and function of cells within the BAL fluid and to preserve viability to facilitate the growth of cells in ex vivo culture. The research technique therefore uses a larger volume instillate (typically in the order of 200 ml) and employs manual suction to reduce cell damage.
Patients are given local anesthetic, offered conscious sedation (midazolam), and tolerate the procedure well with minimal side effects. Verbal and written subject information improves tolerance and written informed consent is mandatory. Safety of the subject is paramount. Subjects are carefully selected using clear inclusion and exclusion criteria.
This protocol includes a description of the potential risks, and the steps taken to mitigate them, a list of contraindications, pre- and post-procedure checks, as well as precise bronchoscopy and laboratory techniques.

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy and bronchoalveolar lavage using low pressure suction. The technique is used to harvest immune cells from the lung bronchoalveolar surfaces. Local anesthetic and mild conscious sedation (midazolam) is used. Subjects tolerate the procedure well and experience minimal side effects.

研究のための気管支肺胞洗浄（BAL）、適切なサンプル利回りの取得

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

再発神経膠芽腫の治療のためのベバシズマブと組み合わせてフィールド療法の治療腫瘍

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

マウスで静脈-静脈体外膜型人工肺

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...