여기에서 우리는 대변 샘플 수집에서 장의 변화를 연구하기 위해 스위스 롤 방법을 사용하는 것까지 질병의 dysbiosis의 메커니즘을 조사하는 데 다른 사람들을 안내하는 프로토콜을 설명했습니다. 먼저 안락사된 쥐의 가슴과 옆구리에 70% 에탄올을 뿌리고 피부와 복강을 조심스럽게 열어 위장관을 노출시킵니다. 맹장을 분리하고 멸균 수술 용 가위를 사용하여 반으로 자릅니다.
맹장을 잠깐 노출시키고 회장에서 근위부로 0.5cm, 결장과의 접합부에서 원위부로 0.5cm를 자릅니다. 분리된 맹장을 멸균된 페트리 접시에 옮깁니다. 멸균 주걱을 사용하여 맹장 내용물을 멸균 튜브로 옮기고 분취량을 섭씨 80도 냉동고에 보관하십시오.
신선하거나 이전에 냉동된 배설물 펠릿을 멸균 식염수에 1 내지 20 비율로 다시 현탁하고 균질화될 때까지 소용돌이친다. 균질액을 30마이크로미터 기공 나일론 필터에 통과시켜 큰 입자상 물질을 제거합니다. 79G에서 5분 동안 원심분리하고, 이식에 사용할 상층액을 수집한다.
무균 수용자 마우스당 슬러리를 100 마이크로리터의 경구 위관영양법으로 연속 3일 동안 위관영양하고, 2주 동안 3일마다 위관영양법을 시행하였다. 예열된 마우스 홀더의 고정 장치에 마우스를 부드럽게 놓고 꼬리를 바깥쪽에 둡니다. 마우스에 스트레스가 가해지지 않도록 꼬집지 않고 조심스럽게 상단을 테이프로 감습니다.
마우스를 홀더에 놓고 테일 커프 기계 플랫폼에 3-5분 동안 놓고 시트로 덮어 적응시킵니다. 꼬리 커프 혈량 측정법을 사용하여 최소 3라운드의 수축기 혈압 측정값을 수집하고 각 동물의 평균 수축기 혈압에 대한 모든 라운드의 측정값을 평균합니다. 안락사 된 마우스에서 맹장 내용물을 무균 적으로 수집합니다.
내장 및 기타 조직을 채취하려면 마우스에서 조직을 찾아 가위로 절제하여 심장 대사 건강에서 장내 미생물총의 역할을 조사합니다. 첫째 날에는 항문 쪽에서 위 쪽으로 쥐의 내장을 해부합니다. 그리고 분리된 위장관 전체를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
위 끝에서 근위 끝을 부드럽게 당기고 주변 지방과 결합 조직을 손으로 제거합니다. 소장을 분리하고 각 길이마다 Z 형 지그재그를 만듭니다. 그런 다음 십이지장, 공장 및 회장을 얻기 위해 절단합니다.
맹장 아래의 장 부분을 절단하여 결장을 분리하십시오. 십이지장, 공장, 회장 및 결장을 자릅니다. 주사기와 볼 팁이 있는 바늘을 사용하여 장을 찢지 않고 PBS로 내장을 조심스럽게 씻어내고 씻습니다.
거트를 여과지에 놓고 섹션 이름을 종이에 붙인 다음 왼쪽 상단 모서리에 근위부에 P를, 왼쪽 하단 모서리에 원위부에 D를 표시합니다. 볼팁 가위로 내장을 세로로 자릅니다. 여과지의 내장을 열고 필요에 따라 더 많은 PBS로 씻으십시오.
두 개의 여과지 사이에 내장을 끼우고 내장 근처의 네 지점 또는 모서리에 여과지를 스테이플링합니다. 10% 포르말린 중성 완충 용액에 담그고 플랫폼 로커를 사용하여 실온에서 밤새 5rpm으로 흔들어 줍니다. 둘째 날에, 알루미늄 호일로 덮인 비이커에서 교반 막대로 증류수에 준비된 2 % 아가로스를 가열한다.
조직을 회수하려면 상부 여과지를 벗겨내고 근위부에서 내장을 굴려 근위부가 먼저 안쪽으로 들어가도록 하고 안쪽으로 굴려서 내강이 슬라이드 안쪽에도 오도록 합니다. 필요에 따라 30게이지 바늘 한두 개로 고정합니다. 일회용 졸업 파이펫을 사용하여 1 밀리리터의 아가로스를 흡인하고 조직의 기포를 피하면서 평평한 표면의 압연 된 내장 부분에 아가로스를 붓습니다.
아가로스가 식고 굳은 후 면도날을 사용하여 조직 섹션 주변의 여분의 아가로스를 다듬습니다. 마지막으로 장 부분을 조직 처리 또는 내장 카세트에 넣고 섭씨 4도에서 70 % 에탄올에 담급니다. 정상적인 염분 사료와 고염 사료를 섭취한 쥐에서 얻은 맹장 함량의 종 생물다양성 추정치가 여기에 나와 있습니다.
높은 염분에 대한 장내 미생물총의 변화에는 박테리아 생물다양성의 감소가 포함되었습니다. 비미터법 다차원 스케일링은 정상 염분 및 고염식 생쥐의 박테리아가 별도의 클러스터를 형성한다는 것을 보여줍니다. 높은 염분은 Firmicutes 대 Bacteroidetes 비율 증가와 관련이 있습니다.
고염분 먹이 마우스의 분변 미생물군 이식은 무균 마우스를 안지오텐신 II 유발 고혈압에 걸리게 합니다. 고염분 유도 dysbiotic 장내 미생물군을 옮기는 것은 정상 염분 장내 미생물군을 투여받은 쥐에 비해 무균 쥐에서 수축기 혈압이 크게 증가하는 것과 관련이 있었습니다. 대표적인 이미지는 단백뇨가 없거나 없는 고지혈증이 있는 마우스에서 얻은 장골에서 아포지단백 A-I 염색을 보여줍니다.
이 프로토콜은 인간과 설치류 기증자 모두에 대한 주요 실험 고려 사항에서 성공적인 FMT를 달성하기 위한 단계를 조정합니다.
