このプロトコルは、F0 CRISPR注入ゼブラフィッシュ精子を使用して数千のゲノムを迅速にスクリーニングする方法を説明しています。この手法は、そのアクセシビリティにおいて有利です。高価で特殊なシーケンシングベースのアプローチではなく、PCR制限酵素とゲル電気泳動を使用して、インデルまたは特定のゲノム編集についてF0オスキャリアをスクリーニングします。
この手順の最も難しい部分は、精子をすばやく取得することですが、多くの異形魚を扱う場合、体外受精に適した技術になるため、問題を引き起こしている魚を簡単に交配できます。野生型とF0魚の両方の繁殖タンクを設置することから始め、タンクを一晩インキュベートします。翌日オスの魚に麻酔をかけた後、スロット付きスプーンを使用して、清潔なペーパータオルのスタックに移します。
魚をそっと転がして余分な水分を取り除きます。きれいな折りたたんだティッシュで吸い取って乾かして、水を取り除きます。スロット付きスプーンを使用して、準備したスポンジに魚を移します。
魚の腹側を上にして置き、きれいに折りたたまれたティッシュペーパーで肛門鰭の周りをそっと拭きます。精子を収集するには、毛細血管を使用して骨盤のひれを正中線からそっと離し、クロアカを露出させます。毛細管をクロアカの近くに置きます。
指またはフィルター鉗子で、魚の側面をえらから下にそっと絞ります。毛細管現象を使用して、チューブ内の精子を収集し、40マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウム溶液を含むPCRチューブに入れ、サンプルをチューブに排出します。精子サンプルをミニ遠心分離機で回転させた後、PCRチューブをサーマルサイクラーに入れます。
サンプルを摂氏40度で95分間加熱した後、摂氏25度で冷却してサイクラーを実行します。サイクラーからサンプルを除去した後、pH8の1モルトリス塩酸塩を10マイクロリットル添加してpHを中和する。懸濁液を吸引して混合し、サンプルを遠心分離します。
予熱のためにサーマルサイクラーを摂氏95度に設定します。そしてその間に、各精子サンプルに対して25マイクロリットルのPCR反応混合物を調製する。上下にピペッティングしてよく混合し、サンプルを回転させます。
サンプルを予熱したサーマルサイクラーに入れ、サイクルを設定します。ゲル溶液を得るには、アガロース粉末、ゲル染色剤、およびTBE緩衝液を混合した4%アガロースゲル溶液をマイクロ波で加熱する。ゲル溶液をゲルキャスティングフレームに注ぎ、片側に櫛を挿入します。
ゲル固化後、慎重に櫛を取り外します。ウェルが負極に最も近くなるように、ゲルを電気泳動リグに入れます。ウェルが完全に水没するまで、TBEランニングバッファーをリグに注ぎます。
5マイクロリットルのDNAラダーを最初のウェルにピペッティングしてゲルをロードし始めます。残りのウェルに5〜10マイクロリットルのPCR産物をロードします。アンプリコンを適切に分離するために、ゲルを150ボルトで1時間実行します。
ゲルイメージャーを使用して、DNAバンドを表示します。p2ry12遺伝子座解析では、野生型アンプリコンは250塩基対長の単一バンドを示し、インデルを含むF0注入雄アンプリコンは複数のバンドとして走った。DNAH10遺伝子座解析は、野生型アンプリコンが単一の400塩基対長バンドとして実行されることを示した。
インデルを含むF0注入雄アンプリコンは、複数のバンドとして、またはゲルの移動度が低下した単一のバンドとして実行されました。F0を注射したオスナンバーワンは、PCR産物には存在しなかった消化産物に追加のバンドがあり、変異体ノックインライン確立の最良の創始候補となっています。オスの魚が絞っても精子を出さない場合は、魚を強く絞って傷つける危険を冒すのではなく、魚を一週間休ませて再試行するのが最善です。
FCまたは男性の創設者が交配したら、対立遺伝子をF1子孫で配列検証する必要があります。F1アンプリコンを直接シーケンシングし、ヘテロ接合対立遺伝子分析を実行することは、これを行う簡単な方法です。
