この方法の全体的な目的は、単一細胞と集団レベルの両方で、細菌細胞に対するストレス処理の効果を分析することです。細胞の生存率、形態、DNA含有量など、細菌増殖のいくつかの側面に対するストレスの影響に関するグローバルなビジョンを提供します。また、人口の回復を特徴付けることもできます。
この方法は、新しい抗菌分子の活性をスクリーニングし、細菌の生存率と成長への影響を理解するために製薬業界で使用することができます。ストレス誘発治療は、用量や時間依存性などの非効率性を有する。このプロトコルを開始する前に、最適な用量と治療期間を決定するために予備試験を実行する必要があるかもしれません.
この方法の視覚的なデモンストレーションでは、重要な各ステップの重要な詳細と、それらを適切に実行する方法を描きます。まず、大腸菌MG1655 HU-PAmCherryの単一コロニーでMOPS EZリッチデファディアルミディアムの5ミリリットルを接種し、一晩で毎分140回転で揺れで摂氏37度で成長します。翌朝、サンプル100マイクロリットルを抽出し、900マイクロリットルの培地で希釈し、600ナノメートルで光学密度を測定します。
次いで、0.01のOD600ナノメートルに新鮮な培地を含む試験管で培養を希釈する。光学密度が0.2に達するまで140 RPMで振盪して37°Cで接種試験管をインキュベートし、豊富な媒体で完全指数相に対応します。次いで、タイムラプス顕微鏡イメージング用の培養サンプルをアリコートし、希釈およびめっきアッセイ、フローサイトメトリー解析、および顕微鏡観察スナップショットイメージングを行う。
試験管内の残りの4.4ミリリットルの細胞培養を特定のストレス処理にさらします。例えば、セファレキシンの4.4マイクロリットルは1ミリリットル当たり5マイクログラムで、140RPMで振ると摂氏37度でインキュベートする。新鮮な培地で培養サンプル200マイクロリットルの10倍の連続希釈物(マイナス7分の1まで)を調製します。
非常に穏やかな渦または管を反転させることによって、各希釈間の混合。選択されていないLBアガロースプレート上の適切な希釈液のプレート100マイクロリットルを、摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、コロニー数を数えて、各培養サンプル中の生存細胞の濃度を決定する。
未処理および処理された細胞培養のための時間の関数として、ミリリットル当たりのCFUをプロットします。分光光度計で培養液のOD600を測定します。培養サンプルを新鮮な培地を摂氏4度で希釈し、OD600の0.06で、マイクロリットル当たり約15,000細胞に相当するサンプルを得る。
DNA染色の場合は、希釈した細菌サンプルを1~1の体積配給でDNA蛍光色素1ミリリットル溶液あたり10マイクログラム混合し、暗闇の中で15分間インキュベートします。サンプルを注入する前に、非常に穏やかな渦または管を反転させることによってサンプルを混ぜます。1分間に約120,000細胞の流量で、フローサイトメーターにサンプルを渡します。
適切な設定で、前方散乱光や横散乱光、DNA蛍光色素/蛍光シグナルを取得します。前方散乱細胞密度ヒストグラムをプロットして細胞サイズの分布を表し、DNA蛍光色素/蛍光シグナル細胞密度ヒストグラムをプロットして、細胞集団中のDNA含有量を表します。まず、温度を安定させるために37°Cで熱式顕微鏡室を予熱します。
原稿に記載されているようにアガロースに取り付けられたスライドを準備します。顕微鏡のステージにスライドを置き、mCherryの場合は560ナノメートルで顔コントラストの目的と光源励起を有する透過光を使用して画像取得を行います。画像解析中に細胞を自動検出するために、分離されたセルを含む視野を選択します。
セルの母集団を確実に統計的に分析できるように、少なくとも 300 個のセルが画像化されていることを確認してください。まず、マイクロ流体プレートから保存液を取り出し、マイクロ流体ソフトウェアユーザーガイドに記載されているように、37°Cに予熱された新鮮な媒体に交換します。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムに取り付けます。
マイクロ流体ソフトウェアで、シールボタンをクリックして、プレートをマニホールドシステムにシールします。その後、プライミングボタンをクリックします。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムと共に顕微鏡ステージに配置し、マイクロ流体室の拡張を避けるために摂氏37度で2時間予熱します。
「シールオフ」ボタンをクリックして、マイクロ流体システムのマイクロ流体プレートをシールします。ウェル8から培地を150マイクロリットルの培養サンプルに交換し、ストレス誘発試薬の有無にかかわらず、ウェル1から5までの培地を所望の培地に交換します。マイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡ステージに置きます。
マイクロ流体ソフトウェアで、セルのロード手順を実行します。透過光で顕微鏡の下を見て、細胞の負荷が十分であることを確認してください。透過光モードに注意深く焦点を当て、単離された細菌を示し、過密ではないいくつかの視野を選択し、100平方マイクロリットルあたり約10〜20細胞。
マイクロ流体ソフトウェアでは、[カスタムシーケンスを実行]ボタンをクリックし、2つのPSIで10分間にストレス誘発媒体の注入をプログラムし、続いてストレス治療の必要期間に1つのPSIで注入します。10分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを行い、必要に応じて透過光の位相コントラストとmCherry信号用の560ナノメートル励起光源を使用します。顕微鏡画像取得とマイクロ流体注入プロトコルを同時に開始します。
フィジーのソフトウェアとMicrobeJプラグインを開きます。スナップショット解析では、1つの顕微鏡スライドに対応するすべての画像をMicrobeJのローディングバーにドロップして画像を連結し、取得した画像スタックファイルを保存します。タイムラプスデータの場合は、画像スタックをMicrobeJのローディングバーにドロップするだけです。
位相コントラスト画像のセグメンテーションに基づいて細胞の輪郭の自動検出を実行し、染色されたDNA蛍光シグナルのセグメンテーションに基づいて核oidの検出を実行します。細胞検出の精度を視覚的に確認し、必要に応じてMicrobeJ編集ツールを使用して補正を行います。取得した結果ファイルを保存します。
[ResultJ] アイコンをクリックして解析を完了し、[ResultJ] ウィンドウを表示します。出力グラフの種類はさまざまです。細胞の形状または長さの正規化されたヒストグラムをプロットし、セルあたりの有核数を示します。
この研究では、細胞分裂を特異的に阻害する抗生物質であるセファキシンへの一過性暴露時の大腸菌K-12細胞の挙動を分析した。セファキシンの存在下で増殖する細胞培養物は、無ストレス培養物と同様のOD600増加を示した。セファレクシンが存在すると生存細胞の濃度は増加しなかった。
細胞はセファレックスを除去すると再び分裂を開始し、最終的には2時間後に無ストレス培養物と同等の濃度に達した。異なる応力は、誘導された効果に応じて、1ミリリットル曲線当たりのODおよびCFUの異なる結合解除をもたらした。セファレクシンへの暴露は、細胞サイズおよびDNA含有量の並行増加を引き起こした。
セファレクシンを除去すると、集団細胞サイズとDNA含有量は徐々に減少し、2時間後にストレスを受けていない集団と類似した状態になった。セファレクシンは、正常な細胞幅を有する長い細胞の形成を引き起こし、その後、分裂セプタはなかった。定量的画像解析により、細胞サイズおよびDNA含有量の増加が確認された。
タイムラプス画像は、細胞伸長および染色体複製および分離がセファレシンへの暴露によって阻害されないことを確認する。フィラメント細胞系統の分析は、薬物を洗い流した後、細胞分裂が約20分後に再開したことを示した。ストレス治療を誘発する前に、細菌集団が完全な指数関数的成長を遂げていることを確認することが重要です。
これらのアプローチに使用されるストレス誘発治療は、遺伝子毒性化合物のような実験的な有害である可能性があります。だから慎重に化合物を扱い、手袋、マスク、ゴーグル、ラボコートを着用してください。
