このプロトコルは、厚い材料の放射輝度測定を簡素化および可能にし、生命システムを研究する際に重要な情報を収集できるため、重要です。この技術の主な利点は、構築可能な機器とフィールドラボで実行できる実験を使用して、吸収性の高い材料の空間分解スペクトル測定を可能にすることです。この方法は、あらゆる生命システムに適応して適用することができます。
プローブを作成するテクニックは微妙ですが、練習は完璧になります。プローブする材料に応じて測定技術を調整し、組織の位置をより確実にし、プローブの摩擦を低減する変更を加えます。5.75インチのパスツールピペットでガラススリーブを作り始めます。
取り付け可能なワニ口クリップを使用して、テーパーの端が床に向かって下を向き、ピペットの向きが床に垂直になるように、ガラスピペットを広い端で取り付けます。滑りを防ぐために50グラムのプラスチック製バイスグリップに電気テープのパッドを置き、ピペットのテーパー端からバイスグリップを吊るします。小さなブタントーチを使用して、原稿に記載されているようにピペットのテーパー端を加熱します。
ピペットの長さが約5インチ増加したら、すぐに炎を取り除きます。次に、小さなはさみまたはガラスカッターを使用して、ピペットの引っ張られた端を切り取ります。カーボランダム紙を使用してトリミングされた端の鋭い領域をやすりで削り、イソプロピルアルコールとそれに続く圧縮空気を使用して、小さなガラスの破片やほこりを洗い流します。
かみそりの刃を使用して光ファイバを切断し、SMA終端光ファイバの1つのSMAコネクタを取り外します。SMA終端の1つの近くで切断してください。次に、次の5センチメートルのプラスチックとグラスファイバーのジャケットを取り外して、むき出しの光ファイバーが露出し、アセンブリ全体の残りの部分から突き出るようにします。
ブタントーチを使用して、ガラス繊維からポリアミドポリマーコーティングを焼き払います。イソプロパノールですすぎ、糸くずの出ないワイプを使用して裸のガラス繊維を拭きます。次に、光ファイバのむき出しの端をテーブルまたは棚の端にあるプライヤークランプに直接取り付け、ファイバのSMA終端端を床に向かってぶら下げます。
裸の光ファイバがプライヤークランプに保持されている場所から約4〜6インチ、ファイバのジャケット付き端にある2つの小さなクランプを使用して引っ張るためのウェイトを追加します。繊維を引っ張るには、ブタントーチの炎をつけて始めます。原稿に記載されているように、ブタントーチを裸繊維から1センチ離します。
そして、繊維を伸ばしたり、引っ張ったり、分離したり、床に落としたりします。顕微鏡で繊維を確認し、必要に応じて小さな解剖はさみで繊維の端を切り取ります。フォーム不透明なペンを使用して、ファイバーの側面を暗くし、迷光の侵入を防ぎます。
ペンの先端をファイバー全体にそっと引っ張り、先端の小さな領域だけを覆い隠します。実体顕微鏡で、テーパー状の光ファイバを変形したガラスピペットの広い方の端に注意深く挿入し、ピペットのテーパー状の端から約1ミリメートルの裸のファイバが突き出るまでファイバを押します。電気テープを使用して、光ファイバのジャケット付き端をピペットの広い端に固定します。
シアノアクリレート接着剤を小さなゲージの針に一滴入れます。引っ張られた繊維のむき出しの端を避けて、引っ張られたピペットの切断端に接着剤の滴を慎重に触れます。散乱球で繊維先端を修正するには、UV硬化型接着剤の滴と二酸化チタン粉末を等しい比率で混合して原料を作成します。
プローブが水平方向になるように、取り付けロッドホルダー付きのマイクロマニピュレーターにプローブを取り付けます。接着剤の液滴が形成されるように準備した混合物にワイヤーまたは針の先端を浸すことによって散乱物質の作業リザーバーを準備する。ワイヤーまたは針を水平プローブの先端近くの液滴で取り付けます。
プローブの先端に散乱球を堆積させます。マイクロマニピュレーターを使用して、プローブの光ファイバーの先端を準備された混合物にゆっくりと慎重に押し込みます。次に、すぐに接着剤から先端を引き出し、散乱ボールを顕微鏡で観察します。
所望のサイズの接着剤の球状の液滴が光ファイバの先端に堆積するまで繰り返す。サンプルを取り付ける皿を準備します。ブタントーチを使用して、パスツールピペットの大きい方の端を加熱し、プラスチック製のペトリ皿の底にある直径0.5センチメートルの穴を溶かします。
皿の底面の穴を電気テープまたはラボテープで塞ぎます。次に、1つのペトリ皿を4分の1まで満たし、2番目のペトリ皿に液体ゼラチンを入れ、ゲル化の直前に室温まで冷却します。1つの皿に、皿の底の穴に形成された粘性ゼラチンのクッションに生検を置きます。
パスツールピペットを使用して、ペトリ皿がいっぱいになるまで生検の周りに室温のゼラチンをそっと加えます。ブランクサンプルには、ゼラチンのみで満たされた皿を使用してください。プローブを光源に向けるように垂直方向のマウントに取り付け、クランプ、ホースクランプ、またはテープでプローブを光学テーブルポストに固定します。
プローブの光ファイバのSMA終端端をUSB光ファイバー分光器に接続し、USBケーブルを使用して分光器をコンピューターに接続します。プローブとマニピュレーターを、データが収集される正確な位置に配置します。綿棒、ファインゲージ針、またはスポイトを使用して、組織に挿入されるプローブの部分に少量のシリコーン潤滑剤を慎重に塗布し、プローブの側面と組織サンプルの間の摩擦を減らします。
次に、サンプルペトリ皿の穴を覆っているテープをはがしてサンプルホルダーに入れ、摩擦によってしっかりと固定されていることを確認します。マイクロマニピュレーターを使用してサンプルをプローブに降ろし、プローブがペトリ皿の下側にある穴からゼラチンに入るようにします。プローブがゼラチン層の底から約5ミリメートルになるまで続けます。
光源をオンにします。分光器ソフトウェアを使用して、信号ができるだけ高くなるまで分光器の統合時間を調整しますが、飽和しません。平均スキャン数を 2 から 5 の間で設定し、スムージング ピクセルの値を 6 に設定します。
この段階で使用可能な統合時間は、このベースラインで 1 ミリ秒から 15 ミリ秒の間で変化します。積分時間が測定に適していることを確認するには、スペクトルのノイズが多すぎず、飽和していないことを確認します。必要に応じて積分時間を変更します。
マイクロマニピュレーターを使用してサンプルを指定された距離下に移動し、測定を実行します。組織内の各垂直位置でスペクトルを保存し続けます。組織を通って現れるプローブの顕微鏡的外観が視覚化されます。
ベースラインに対する異なる組織深度での光の割合が示されています。覚えておくべき最も重要なことは、これらのプローブは壊れやすいので、先に進む前に時間をかけてプローブジャンクションが安全であることを確認してください。プローブを作成した後、測定技術を適応させることができます。
たとえば、散乱ボールがない場合、プローブを使用して、検出器に到達する放射輝度を一方向から測定できます。このプローブを開発した後、研究者は私たちの測定装置のバリエーションを使用して、マウスの脳と脂肪組織の両方の内部の光を測定することができました。これは、組織の深部に存在する光受容体を活性化するのに十分な光があるかどうかという質問に答えるのに役立ちました。
