Bu protokol önemlidir, çünkü kalın malzemelerde parlaklık ölçümlerini basitleştirir ve izin verir, bu da canlı sistemleri incelerken önemli bilgiler toplamamıza izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, inşa edilebilen ekipman ve saha laboratuvarlarında çalıştırılabilen deneyler kullanılarak yüksek emici malzemelerde mekansal olarak çözülmüş spektral ölçümlere izin vermesidir. Bu yöntem herhangi bir canlı sisteme uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Probları yapma tekniği nüanslıdır, ancak pratik mükemmelleştirir. İncelenen malzemeye bağlı olarak ölçüm tekniğini ayarlayın ve daha güvenli doku pozisyonu ve daha düşük prob sürtünmesi ile sonuçlanan değişiklikler yapın. Cam manşonu 5,75 inç Pasteur pipetle oluşturmaya başlamak için.
Takılabilir bir timsah klipsi kullanarak, cam pipeti, konik ucu yere bakacak ve pipetin yönü zemine dik olacak şekilde geniş uca monte edin. Kaymayı önlemeye yardımcı olmak için 50 gramlık plastik mengene tutamağının üzerine bir elektrik bandı pedi yerleştirin ve mengene sapını pipetin konik ucundan asın. Küçük bir bütan meşalesi kullanarak, pipetin konik ucunu makalede açıklandığı gibi ısıtın.
Pipet uzunluğu yaklaşık beş inç arttığında, alevi hemen çıkarın. Ardından, pipetin çekilen ucunu kesmek için küçük makas veya cam kesici kullanın. Carborundum kağıdı kullanarak kesilmiş ucun keskin alanlarını törpülayın ve küçük cam kırıklarını veya tozları izopropil alkol ve ardından basınçlı hava kullanarak durulayın.
Optik fiberi kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve SMA ile sonlandırılmış optik fiberin bir SMA konektörünü çıkarın. SMA sonlandırmalarından birine yakın kestiğinizden emin olun. Ardından, aşağıdaki beş santimetrelik plastik ve fiberglas kılıfı çıkarın, böylece çıplak optik fiber açığa çıkar ve tüm montajın geri kalanından çıkıntı yapar.
Poliamid polimer kaplamayı cam elyafından yakmak için bütan torcunu kullanın. İzopropanol ile durulayın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak çıplak cam elyafını silin. Şimdi optik fiberin çıplak ucunu doğrudan bir masa veya raf kenarındaki bir pense kelepçesine monte edin ve fiberin SMA ile sonlandırılmış ucunun zemine doğru sarkmasına izin verin.
Çıplak optik fiberin pense kelepçesinde tutulduğu yerden yaklaşık dört ila altı inç uzakta, fiberin ceketli ucunda iki küçük kelepçe kullanarak çekmek için ağırlıkları ekleyin. Elyafı çekmek için, bütan meşale alevi ile başlayın. Bütan meşalesini, makalede açıklandığı gibi çıplak elyaftan bir santimetre uzakta tutun.
Ve elyafın gerilmesine, çekilmesine, ayrılmasına ve yere düşmesine izin verin. Elyafı mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse elyafın ucunu küçük diseksiyon makası ile kesin. Elyafın kenarlarını koyulaştırmak ve başıboş ışığın girmesini önlemek için köpük opak bir kalem kullanın.
Kalemin ucunu elyaf boyunca yavaşça çekin ve uçta sadece küçük bir alanı açıkta bırakın. Stereo mikroskop altında, konik optik fiberi değiştirilmiş cam pipetin geniş ucuna dikkatlice yerleştirin ve pipetin konik ucundan yaklaşık bir milimetre çıplak fiber yapışana kadar fiberi itin. Elektrik bandını kullanarak optik fiberin ceketli ucunu pipetin geniş ucuna sabitleyin.
Küçük bir ölçü iğnesinin üzerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı koyun. Yapıştırıcı damlasını, çekilen pipetin kesilmiş kenarına dikkatlice dokundurarak, çekilen elyafın çıplak ucundan kaçının. Fiber ucunu bir saçılma küresi ile değiştirmek için, bir damla UV kürlenebilir yapıştırıcıyı eşit oranda titanyum dioksit tozu ile karıştırarak hammaddeyi oluşturun.
Probu, prob yatay yönde olacak şekilde bir montaj çubuğu tutucusu olan bir mikromanipülatöre takın. Bir tel veya iğnenin ucunu hazırlanan karışıma batırarak saçılma malzemesinin çalışma rezervuarını hazırlayın, böylece bir yapışkan damlacık oluşur. Teli veya iğneyi yatay probun ucuna yakın damlacıkla monte edin.
Probun ucuna bir saçılma küresi koyun. Probun optik fiberinin ucunu hazırlanan karışıma yavaşça ve dikkatlice itmek için mikromanipülatörü kullanın. Daha sonra hızlı bir şekilde ucu tutkaldan çeker ve saçılma topunu mikroskopta görüntüler.
Optik fiberin ucunda istenen boyutta küresel bir yapışkan damlacığı birikinceye kadar tekrarlayın. Numuneleri monte etmek için bulaşıkları hazırlayın. Bir bütan meşalesi kullanarak, plastik bir Petri kabının altındaki 0,5 santimetre çapında bir deliği eritmek için bir Pasteur pipetinin büyük ucunu ısıtın.
Çanağın alt tarafındaki deliği elektrik bandı veya laboratuvar bandı ile kapatın. Daha sonra bir Petri kabını yolun dörtte birini ve ikinci bir Petri kabını sıvı jelatin ile doldurun ve jelasyondan hemen kısa bir süre sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Bir tabakta, biyopsiyi, yemeğin altındaki delikte oluşan viskoz jelatin yastığına yerleştirin.
Bir Pasteur pipet kullanarak, Petri kabı dolana kadar biyopsi etrafına yavaşça oda sıcaklığında jelatin ekleyin. Boş numune için, sadece jelatinle doldurulmuş tabağı kullanın. Probu, ışık kaynağına işaret edecek şekilde dikey olarak yönlendirilmiş bir montaja takın ve probu kelepçeler, hortum kelepçeleri veya bantla optik bir masa direğine sabitleyin.
Probun optik fiberinin SMA ile sonlandırılmış ucunu bir USB fiber optik spektrometreye bağlayın ve spektrometreyi bir USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayın. Probu ve manipülatörleri, verilerin toplanacağı tam olarak hizalanmış konumda tutun. Probun kenarları ile doku numunesi arasındaki sürtünmeyi azaltmak için probun dokuya yerleştirilecek kısmına az miktarda silikon yağlayıcıyı dikkatlice uygulamak için pamuklu çubuk, ince ölçülü iğne veya damlalık kullanın.
Şimdi, numune Petri kabındaki deliği kaplayan bandı çıkarın ve sürtünme ile güvenli bir şekilde yerinde tutulduğundan emin olarak numune tutucuya yerleştirin. Numuneyi probun üzerine indirmek için mikromanipülatörü kullanın ve probun Petri kabının alt tarafındaki delikten jelatine girmesine izin verin. Prob, jelatin tabakasının tabanından yaklaşık beş milimetre olana kadar devam edin.
Işık kaynağını açın. Spektrometre yazılımını kullanarak, sinyal mümkün olduğunca yüksek olana kadar spektrometre entegrasyon süresini ayarlayın, ancak doygun değil. Ortalama tarama sayısını iki ile beş arasında ve düzgünleştirici piksellerin değerini altı olarak ayarlayın.
Bu aşamada kullanılabilir entegrasyon süreleri, bu taban çizgisi için bir ila 15 milisaniye arasında değişebilir. Spektrumun çok gürültülü veya doygun olmadığından emin olarak entegrasyon süresinin ölçüm için uygun olduğunu doğrulayın. Gerekirse entegrasyon süresini değiştirin.
Mikromanipülatörü kullanarak numuneyi belirli bir mesafeden aşağı doğru hareket ettirin ve ölçümleri gerçekleştirin. Spektrumları doku içindeki her dikey pozisyonda kaydetmeye devam edin. Dokudan çıkan probun mikroskobik görünümü görselleştirilir.
Taban çizgisine göre farklı doku derinliklerindeki ışığın yüzdesi gösterilir. Hatırlanması gereken en önemli şey, bu probların kırılgan olduğudur, bu nedenle zaman ayırın ve devam etmeden önce prob bağlantılarının güvenli olduğundan emin olun. Probu yaptıktan sonra, ölçüm teknikleri uyarlanabilir.
Örneğin, saçılma topu olmadan, dedektöre tek bir yönden ulaşan parlaklığı ölçmek için problar kullanılabilir. Bu probu geliştirdikten sonra, araştırmacılar ölçüm cihazımızdaki bir varyasyonu kullanarak farelerde hem beyin hem de yağ dokusu içindeki ışığı ölçebildiler. Bu, dokunun derinliklerinde bulunan fotoreseptörleri aktive etmek için yeterli ışık olup olmadığı sorusuna cevap vermeye yardımcı oldu.
