Ce protocole est important car il simplifie et permet des mesures de radiance dans des matériaux épais, ce qui nous permet de recueillir des informations importantes lors de l’étude des systèmes vivants. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet des mesures spectrales à résolution spatiale dans des matériaux hautement absorbants à l’aide d’équipements pouvant être construits et d’expériences pouvant être menées dans des laboratoires de terrain. Cette méthode peut être adaptée et appliquée à n’importe quel système vivant.
La technique de fabrication des sondes est nuancée, mais la pratique rend parfait. Ajustez la technique de mesure en fonction du matériau à sonder et apportez des modifications qui se traduisent par une position plus sûre des tissus et une friction de la sonde plus faible. Pour commencer, construisez le manchon en verre avec une pipette Pasteur de 5,75 pouces.
À l’aide d’une pince crocodile montable, montez la pipette en verre par l’extrémité large de telle sorte que l’extrémité conique soit orientée vers le sol et que l’orientation de la pipette soit perpendiculaire au sol. Placez un tampon de ruban électrique sur une poignée d’étau en plastique de 50 grammes pour éviter le glissement et suspendez la poignée de l’étau à l’extrémité conique de la pipette. À l’aide d’une petite torche au butane, chauffer l’extrémité effilée de la pipette comme décrit dans le manuscrit.
Lorsque la longueur de la pipette a augmenté d’environ cinq pouces, retirez immédiatement la flamme. Ensuite, utilisez de petits ciseaux ou un coupe-verre pour couper l’extrémité tirée de la pipette. Limer toutes les zones pointues de l’extrémité coupée à l’aide de papier carborundum et rincer tous les minuscules éclats de verre ou la poussière avec de l’alcool isopropylique suivi d’air comprimé.
Utilisez une lame de rasoir pour couper la fibre optique et retirez un connecteur SMA d’une fibre optique terminée par SMA. Assurez-vous de couper près de l’une des terminaisons SMA. Ensuite, retirez les cinq centimètres suivants de gaine en plastique et en fibre de verre afin que la fibre optique nue soit exposée et dépasse du reste de l’ensemble.
Utilisez la torche au butane pour brûler le revêtement polymère polyamide de la fibre de verre. Rincer à l’isopropanol et essuyer la fibre de verre nue à l’aide d’une lingette non pelucheuse. Montez maintenant l’extrémité nue de la fibre optique directement dans une pince à pince sur un bord de table ou d’étagère, en laissant l’extrémité SMA de la fibre pendre vers le sol.
Environ quatre à six pouces de l’endroit où la fibre optique nue est maintenue dans la pince, ajoutez les poids pour tirer à l’aide de deux petites pinces sur l’extrémité gainée de la fibre. Pour tirer la fibre, commencez avec la flamme de la torche au butane. Tenez la torche au butane à un centimètre de la fibre nue comme décrit dans le manuscrit.
Et laissez la fibre s’étirer, tirer, se séparer et tomber au sol. Vérifiez la fibre au microscope et coupez l’extrémité de la fibre avec de petits ciseaux à dissection si nécessaire. Utilisez un stylo opaque en mousse pour assombrir les côtés de la fibre et empêcher l’entrée de lumière parasite.
Tirez doucement la pointe du stylo sur la fibre, en ne laissant qu’une petite zone à l’extrémité découverte. Sous un stéréomicroscope, insérez soigneusement la fibre optique conique dans l’extrémité large de la pipette en verre modifié et poussez la fibre jusqu’à ce qu’environ un millimètre de fibre nue dépasse de l’extrémité conique de la pipette. À l’aide de ruban électrique, fixez l’extrémité gainée de la fibre optique à l’extrémité large de la pipette.
Mettez une goutte d’adhésif cyanoacrylate sur une aiguille de petit calibre. Touchez délicatement la goutte d’adhésif sur le bord coupé de la pipette tirée, en évitant l’extrémité nue de la fibre tirée. Pour modifier la pointe de la fibre avec une sphère de diffusion, créez la matière première en mélangeant une goutte d’adhésif durcissable aux UV avec de la poudre de dioxyde de titane dans un rapport égal.
Fixez la sonde à un micromanipulateur muni d’un support de tige de montage de telle sorte que la sonde soit orientée horizontalement. Préparer un réservoir fonctionnel du matériau de diffusion en trempant la pointe d’un fil ou d’une aiguille dans le mélange préparé de telle sorte qu’une gouttelette d’adhésif se forme. Montez le fil ou l’aiguille avec la gouttelette près de la pointe de la sonde horizontale.
Déposez une sphère de diffusion sur la pointe de la sonde. Utilisez le micromanipulateur pour pousser l’extrémité de la fibre optique de la sonde lentement et soigneusement dans le mélange préparé. Ensuite, retirerait rapidement la pointe de la colle et visualiserait la boule de diffusion au microscope.
Répétez l’opération jusqu’à ce qu’une gouttelette sphérique d’adhésif de la taille souhaitée soit déposée sur l’extrémité de la fibre optique. Préparez les plats pour monter les échantillons. À l’aide d’une torche au butane, chauffer la grande extrémité d’une pipette Pasteur pour faire fondre un trou de 0,5 centimètre de diamètre au fond d’une boîte de Petri en plastique.
Scellez le trou sur le côté inférieur de la capsule avec du ruban électrique ou du ruban de laboratoire. Ensuite, remplissez une boîte de Petri au quart du chemin et une deuxième boîte de Petri avec la gélatine liquide et laissez-la refroidir à température ambiante juste avant la gélification. Dans un plat, placez la biopsie dans le coussin de gélatine visqueuse qui s’est formée dans le trou au fond du plat.
À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter doucement de la gélatine à température ambiante autour de la biopsie jusqu’à ce que la boîte de Petri soit pleine. Pour l’échantillon blanc, utilisez uniquement le plat rempli de gélatine. Fixez la sonde à un support orienté verticalement de sorte qu’elle pointe vers la source lumineuse et fixez la sonde à l’aide de pinces, de colliers de serrage ou de ruban adhésif à un poteau de table optique.
Connectez l’extrémité SMA de la fibre optique de la sonde à un spectromètre à fibre optique USB et connectez le spectromètre à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB. Gardez la sonde et les manipulateurs dans la position exacte alignée où les données seront collectées. Utilisez un coton-tige, une aiguille de calibre fin ou un compte-gouttes pour appliquer soigneusement une petite quantité de lubrifiant silicone sur la partie de la sonde qui sera insérée dans le tissu afin de réduire la friction entre les côtés de la sonde et l’échantillon de tissu.
Maintenant, retirez le ruban recouvrant le trou dans la boîte de Petri de l’échantillon et placez-le dans le porte-échantillon, en veillant à ce qu’il soit maintenu en place par friction. Utilisez le micromanipulateur pour abaisser l’échantillon sur la sonde et permettre à la sonde de pénétrer dans la gélatine par le trou situé sous la boîte de Pétri. Continuez jusqu’à ce que la sonde soit à environ cinq millimètres du bas de la couche de gélatine.
Allumez la source lumineuse. À l’aide du logiciel du spectromètre, réglez le temps d’intégration du spectromètre jusqu’à ce que le signal soit aussi élevé que possible, mais pas saturé. Définissez le nombre de balayages moyens entre deux et cinq, et la valeur des pixels de lissage sur six.
Les temps d’intégration utilisables à ce stade peuvent varier entre une et 15 millisecondes pour cette ligne de base. Vérifier que le temps d’intégration est approprié pour la mesure en s’assurant que le spectre n’est ni trop bruyant ni saturé. Modifiez le temps d’intégration si nécessaire.
Déplacez l’échantillon sur une distance spécifiée à l’aide du micromanipulateur et effectuez les mesures. Continuez à sauvegarder les spectres à chaque position verticale dans le tissu. L’aspect microscopique de la sonde qui remonte à travers le tissu est visualisé.
Le pourcentage de lumière à différentes profondeurs de tissus par rapport à la ligne de base est indiqué. La chose la plus importante à retenir est que ces sondes sont fragiles, alors prenez votre temps et assurez-vous que les jonctions de sonde sont sécurisées avant de continuer. Après avoir fabriqué la sonde, les techniques de mesure peuvent être adaptées.
Par exemple, sans la boule de diffusion, les sondes peuvent être utilisées pour mesurer la radiance atteignant le détecteur d’une seule direction. Après avoir développé cette sonde, les chercheurs ont pu mesurer la lumière à l’intérieur du cerveau et du tissu adipeux chez la souris en utilisant une variation de notre appareil de mesure. Cela a aidé à répondre à la question de savoir s’il y avait suffisamment de lumière pour activer les photorécepteurs présents profondément dans le tissu.
