このコンカナバリンAベースのin vitro沈降アッセイは、異なるSTA基質に対するグルカンホスファターゼの結合親和性を測定するように設計されています。このメソッドから得られる情報は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素を理解するための基本です。炭水化物タンパク質の相互作用は比較的弱いため、現在の方法ではグルカンホスファターゼとグルカン相互作用を検出できません。
当社のレクチンベースの沈降アッセイは、ミリモル範囲の結合親和性を検出できます。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質の糖鎖相互作用を定量化するこのアッセイの能力を実証しています。アッセイの最も困難な部分の1つは、基質の濃度範囲を最適化することです。
アイデアを得るためにより広い範囲から始めて、次に特定の範囲に絞り込むことをお勧めします。まず、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10, 000 Gで4°Cで30秒間遠心分離します。
上清を廃棄した後、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを含む各チューブに750マイクロリットルの結合バッファーを追加します。チューブを10, 000 Gで4°Cで1分間遠心分離し、上清を取り除きます。次に、可溶化アミロペクチン溶液の2倍希釈液を調製して、一連の2ミリリットルの希釈アミロペクチン溶液を作る。
ConA-セファロースアミロペクチンビーズを調製するには、250マイクロリットルのConA-セファロースビーズを事前に平衡化し結合バッファーを含むチューブに、希釈した各アミロペクチン溶液250マイクロリットルを加えます。内容物をよく混合し、対応するアミロペクチン濃度でチューブにラベルを付けます。.チューブの内容物を回転ホイール上で4°Cで30分間インキュベートし、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離します。
250マイクロリットルのConA-セファロースアミロペクチンビーズを、10マイクログラムのデンプン過剰の4個またはSEX4タンパク質、10ミリモルのジチオスレイトール、および10マイクロモルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む100マイクロリットルの結合バッファーと混合します。内容物を摂氏4度で45分間、穏やかな回転でインキュベートします。次に、チューブを10, 000 Gで1分間遠心分離し、50マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重にピペットで入れます。
回収した上清画分50マイクロリットルを含む各チューブに20マイクロリットルの4X SDSページ染料と10マイクロリットルの蒸留水を加え、Sとラベル付けします。染料と水を加えた後、すべてのサンプルを摂氏95度で10分間加熱します。ConA-セファロースアミロペクチンSEX4ビーズを10, 000Gで1分間遠心分離したら、上清を保存し、P.Loadとして標識しますSとラベル付けされた40マイクロリットルの未結合タンパク質サンプルを、最低基質濃度から最高濃度まで4〜12%のプレキャストポリアクリルアミドゲルウェルに入れ、タンパク質分子量マーカー用の最初のレーンを確保します。
2番目のゲルを使用して、P.Addとラベル付けされたグルカン結合タンパク質サンプルを装置の両チャンバーにロードし、ゲルを150ボルトで35分間、または色素前面がゲルの底に達するまで流します。次に、装置からゲルカセットを取り出し、スペーサーとガラスプレートを取り外して、ウェスタンブロット分析用のゲルを分離します。5.8グラムのトリス塩基、2.9グラムのグリシン、0.37グラムのSDS、および200ミリリットルのメタノールを含む1リットルの転写バッファーを作ります。
サイズ分離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移すには、ウエスタン転写プロトコルに従ってスポンジ、ろ紙、ゲル、ニトロセルロース膜を組み立て、70ボルトで1時間実行します。ゲルを実行した後、ニトロセルロース膜を50ミリリットルのTBSTバッファー中の1〜5%ウシ血清アルブミンまたは乳タンパク質のタンパク質溶液中で1時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合を防ぎます。TBSTバッファーを使用してメンブレンを3回洗浄し、結合していないブロッキング溶液を除去します。
次に、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体をヒスチジンタグ付きタンパク質に特異的にインキュベートし、メンブレンを1時間インキュベートします。その後、メンブレンをTBSTバッファーで3回洗浄し、未結合の抗体を除去しました。デジタルイメージングの場合は、等量の化学発光基質溶液(1.5ミリリットルのチューブにそれぞれ750マイクロリットル)の溶液を作り、その溶液中でメンブレンを少なくとも5分間インキュベートします。
膜タンパク質側を下にしてブロットスキャナーに置き、取得ソフトウェアを実行して、ペレット画分と上清画分の両方のタンパク質を定量します。データを取得するには、ブロットスキャナーで取得ソフトウェアを使用して定量信号測定を開始します。上清およびペレット画分中のすべての定量的測定値を、負荷された総タンパク質に正規化します。
飽和結合実験では、アミロペクチン濃度に対する結合タンパク質の割合をプロットし、データ解析ソフトウェアを使用してデータを適合させ、解離定数Kd.ConA-セファロースアミロペクチンビーズへのSEX4の結合能をSDSページを用いて分析した。ペレット画分中のSEX4タンパク質および上清画分中のウシ血清アルブミンの存在が注目された。グルカン結合能が有意に低下した既知のSEX4変異体であるW278Aが上清画分に出現し、このアッセイの有用性と特異性を示しています。
ウェスタンブロッティング分析により、SEX4の検出が大幅に増加し、この方法は末端にヒスチジンタグを持つグルカンリン酸の検出に特異的です。共沈降アッセイを3つの異なるSEX4濃度で試験した。化学発光検出で可視化するには2マイクログラムのSEX4で十分ですが、5マイクログラムまたは10マイクログラムのSEX4を使用すると、より正確な検出が可能になります。
また、アミロペクチン濃度の増加に伴うSEX4結合の増加が認められた。異なる濃度でのアミロペクチンとSEX4野生型タンパク質の結合親和性を決定し、特定の1部位結合モデルに結合したタンパク質データの割合は、ミリリットルあたり約1.03ミリグラムのKdを与えた。ジャガイモアミロペクチンに対するラフォリン、LSF2、トウモロコシSEX4、およびジャガイモSEX4の結合を測定するためのこの方法の適用性を評価しました。
結果は、農学的に重要な作物からの試験されたタンパク質もアミロペクチンに差動的に結合していることを実証した。ペレットおよび上清画分におけるすべての定量的測定値の、負荷された総タンパク質に対する正規化を覚えておくことが重要です。すべてのアミロペクチンがビーズに結合していることを確認するには、上清画分を保存して、後でディープグルコースアッセイを実行します。
グルカンホスファターゼは、炭水化物に結合、位置特定、および脱リン酸化するために異なるメカニズムを採用しています。この方法では、位置特異的な脱リン酸化のために、大きなポリマー複合体内の異なる構造ドメインへのグルカンホスファターゼの結合を探索することができます。
