이 프로토콜은 자가면역 공격에 대한 보호 메커니즘을 이해하고 제1형 당뇨병에서 베타 세포 교체를 위한 치료 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 저렴한 비용, 세포 배양, 이식 및 이미징 방법의 단순성뿐만 아니라 마우스 기술의 최소 침습성입니다. 이전에 꼬리 정맥 주사를 한 번도 해본 적이 없는 사람은 바늘을 정맥에 삽입하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
첫 번째 주사 전에 전문가의 시연을 요청하십시오. 시작하려면 마취된 마우스를 잡고 가드가 있는 전기 면도기를 사용하여 등쪽에서 털을 제거하여 피부의 약 1인치 x 2인치를 노출시킵니다. 면도한 마우스를 녹다운 챔버로 되돌립니다.
이식하기 전에 한 번에 한 마리의 마우스를 챔버에서 이소 플루 란 코 콘이 장착 된 깨끗한 표면으로 옮기고 마우스의 머리를 코 콘으로 부드럽게 안내합니다. 이소프로필 알코올 프렙 패드로 면도한 부위를 닦아 느슨한 모발을 제거하고 피부를 소독합니다. 다음으로, 300 마이크로 리터 이상의 세포 현탁액을 26 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 멸균 주사기에 넣습니다.
주사기에서 기포를 제거하고 초과분을 밀어내면서 300마이크로리터의 세포 현탁액을 유지합니다. 주로 사용하지 않는 손에 쥐고 있는 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 마우스 등의 한쪽 피부를 부드럽게 들어 올려 피하 공간에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 주로 사용하는 손을 사용하여 주사기를 마우스 몸의 관상 및 시상 평원과 평행하게 놓습니다.
바늘이 쥐의 머리 쪽을 향하게 하여 뒷부분 근처의 피부에 바늘을 삽입하고 전체 바늘이 피부 아래에 남아 있고 찌르지 않도록 하면서 피하 공간으로 안내합니다. 바늘 바닥 주위의 피부를 고정하도록 집게를 조정합니다. 50 마이크로리터 미만의 세포 현탁액을 천천히 분배하고 주사 부위의 피부 아래에 작은 돌출부가 형성되는지 확인합니다.
최대 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 피하 주사를 계속하십시오. 그런 다음 집게를 제자리에 잡고 바늘을 마우스의 몸과 평행하게 유지하면서 바늘을 빼냅니다. 바늘을 제거한 후 집게로 피부를 닫은 채로 몇 초 동안 유지하여 찔린 상처에서 세포가 새어 나오지 않도록합니다.
이식 후 각 마우스를 신선한 케이지로 옮기고 케이지에 마우스를 추가하기 전에 동물이 마취에서 완전히 회복되도록하십시오. 안락사된 마우스를 등에 대고 수술용 가위를 사용하여 피부에 약 2인치 길이의 수직 절개를 합니다. 마우스의 오른쪽을 잘라내어 밝은 빨간색 비장을 찾습니다.
분홍색 췌장에서 비장을 부드럽게 잘라 내고 5 밀리리터의 멸균 PBS가 들어있는 멸균 10 센티미터 페트리 접시에 옮깁니다. 멸균 주사기 플런저의 평평한 상단으로 비장을 으깬다. 40 또는 70 미크론 스트레이너를 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 놓고 5 밀리리터의 PBS로 프라이밍합니다.
비장 현탁액을 여과기에 옮기고 부드럽게 으깬다. 10 밀리리터의 PBS로 접시를 씻고 세척액을 여과기로 옮깁니다. 여과기에 붉은 색이 남지 않을 때까지 계속 으깬다.
그런 다음 실온에서 5분 동안 500G의 속도로 튜브를 회전시키고 흡인 피펫으로 상층액을 제거한 후 실온으로 예열된 ACK 용해 완충액 5밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하여 실온에서 4분 동안 적혈구 용해를 수행합니다. 용해 완충액 5밀리리터당 5밀리리터의 NIT-1 세포 배지로 반응을 소멸시키고 세포 현탁액을 새로운 여과기를 통해 50밀리리터 원심분리기 튜브에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 튜브를 500G에서 실온에서 5분 동안 회전시킵니다.
다음으로, 세포를 계수하기 전에 20 밀리리터의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 계수 후 실온에서 5분 동안 500G에서 세포를 회전시킵니다. 1.5 밀리리터 안전 잠금 반응 튜브의 멸균 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
즉시 주사하거나 세포를 최대 1 시간 동안 얼음에 보관하십시오. 성체 수용자 NOD SCID 마우스의 몸을 5 내지 10분 동안 열 램프를 이용하여 몸을 따뜻하게 하여 정맥을 혈관 확장시켰다. 각 주사 전에 비장 세포 용액을 다시 일시 중지하십시오.
각 마우스에 대해 예열 된 비장 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 주사기에 넣고 기포가 없는지 확인하십시오. 다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 꼬리를 잡기 전에 마우스를 구속 장치에 넣으십시오. 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나를 찾습니다.
필요한 경우 꼬리를 부드럽게 돌립니다. 70% 이소프로필 알코올이 함유된 소독용 물티슈로 꼬리를 닦습니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 바늘을 꼬리의 중앙 영역에 예각으로 삽입하십시오.
바늘의 경사가 위를 향하도록 하여 바늘을 피부를 통해 몇 밀리미터 밀어 넣습니다. 그런 다음 주사기에 부드러운 압력을 가하여 비장 세포 현탁액을 주입합니다. 주입할 때 바늘이 더 이상 안팎으로 움직이지 않도록 하십시오.
성공적인 주사는 주사 중 배압을 일으키지 않으며 주사 직후 투명 또는 백색 혈류로 표시됩니다. 주사 후 바늘을 정맥 밖으로 부드럽게 떼고 출혈이 멈출 때까지 소독 물티슈로 꼬리에 가벼운 압력을 가하십시오. 구속 장치에서 마우스를 풀고 새로 준비된 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
이미징 최소 5분 전에 1밀리리터 주사기와 26게이지 바늘을 사용하여 적절한 용량의 D-루시페린 용액을 마우스에 복강 주사합니다. 이미징 소프트웨어에 로그인한 후 제어판에서 초기화를 선택합니다. 이미징 데이터를 자동 저장하려면 수집을 클릭한 다음 자동 저장을 클릭하고 컴퓨터에 적절한 폴더를 만듭니다.
측량기 초기화가 완료되면 노출 시간을 1분으로 설정합니다. 마우스를 팔다리를 벌린 상태로 엎드린 자세로 이미징 기구 위에 놓고 머리를 노즈 콘으로 안내합니다. 양손으로 등 중앙을 누른 다음 손을 바깥쪽으로 벌려 마우스를 부드럽게 평평하게 만듭니다.
그런 다음 이미징 소프트웨어에서 팝업 창에서 실험의 관련 세부 정보 획득 및 기록을 선택합니다. 연구된 3마리의 마우스 중 2마리에서, 대조군 이식편은 각각의 생체발광 신호의 손실로부터 명백히 밝혀진 바와 같이 18일째까지 파괴되었다. 그러나 다른 마우스에서는 대조군 이식편이 살아남은 동안 돌연변이 이식편이 파괴되어 동물 간의 생물학적 변이를 강조했습니다.
생체발광 신호를 정량화하고, 이식편 생존율을 제1 시점에서의 신호와 비교한 잔류 생체발광 신호의 백분율로서 보고하였다. 각 마우스에 대한 대조군 이식편에 대한 돌연변이 이식편으로부터의 발광 신호의 비율을 사용하여 동물 간의 변이를 시각화했습니다. 질병이 전이되기 전에 이식된 세포가 복제되어 피부를 통해 볼 수 있는 확장된 이식편이 생길 수 있습니다.
이미징 시 이러한 이식편은 정확하게 정량화할 수 없는 포화 생물발광 신호를 표시했습니다. 이식편은 예를 들어 자가면역 공격 및 이식편 보호의 메커니즘을 조사하기 위해 유세포 분석에 의해 침윤성 면역 세포의 특성화를 위해 다양한 시점에서 단리될 수 있다.
