Этот протокол может помочь понять механизмы защиты от аутоиммунных атак и определить терапевтические мишени для замены бета-клеток при диабете первого типа. Основным преимуществом этой методики является относительно невысокая стоимость, простота методов культивирования клеток, трансплантации и визуализации, а также минимальная инвазивность мышиных методик. Люди, которые никогда раньше не делали инъекцию в хвостовую вену, могут испытывать трудности с введением иглы в вену.
Попросите специалиста провести демонстрацию перед первой инъекцией. Для начала возьмите анестезированную мышь и удалите волосы с ее спинной стороны с помощью электробритвы с защитным кожухом, обнажив примерно один дюйм на два дюйма кожи. Верните бритую мышь в нокдаун-камеру.
Перед пересадкой перенесите по одной мыши из камеры на чистую поверхность, оснащенную носовым конусом изофлурана, и осторожно направьте голову мыши в носовой конус. Протрите бритый участок протритой изопропиловым спиртом, чтобы удалить выпавшие волосы и продезинфицировать кожу. Затем наберите более 300 микролитров клеточной суспензии в стерильный шприц объемом один миллилитр, оснащенный иглой 26 калибра.
Удалите все пузырьки из шприца и сохраните 300 микролитров клеточной суспензии, выталкивая излишки. Используя пару изогнутых щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, осторожно приподнимите кожу с одной стороны спины мыши, чтобы облегчить доступ к подкожному пространству. Затем, используя доминирующую руку, расположите шприц параллельно корональной и сагиттальной плоскостям тела мыши.
Направив иглу к голове мыши, вставьте ее в кожу возле задних четвертей и направьте в подкожное пространство, следя за тем, чтобы вся игла оставалась под кожей и не протыкалась насквозь. Отрегулируйте щипцы, чтобы удерживать кожу вокруг основания иглы. Медленно дозируйте менее 50 микролитров клеточной суспензии и подтвердите образование небольшой выпуклости под кожей в месте инъекции.
Продолжайте вводить до 200 микролитров клеточной суспензии подкожно. Затем, удерживая щипцы на месте и удерживая иглу параллельно телу мыши, извлеките иглу. После того, как игла будет удалена, держите кожу закрытой щипцами в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить утечку клеток из колотой раны.
После трансплантации переведите каждую мышь в новую клетку и дайте животному полностью оправиться от анестезии, прежде чем добавлять дополнительных мышей в клетку. Положив усыпленную мышь на спину, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать вертикальный разрез на коже длиной примерно два дюйма. Разрежьте правую сторону мыши и найдите ярко-красную селезенку.
Аккуратно отрежьте селезенку от розовой поджелудочной железы и перенесите ее в стерильную 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров стерильного PBS. Разомните селезенку плоской верхней частью стерильного поршня шприца. Поместите ситечко размером 40 или 70 микрон на коническую трубку объемом 50 миллилитров и заправьте его пятью миллилитрами PBS.
Переложите суспензию селезенки в ситечко и аккуратно разомните. Вымойте посуду 10 миллилитрами PBS и переложите стирку в ситечко. Продолжайте растирать до тех пор, пока на ситечке не останется красного цвета.
Затем раскрутите пробирку со скоростью 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки, прежде чем ресуспендировать клеточную гранулу в пяти миллилитрах буфера лизиса ACK, предварительно нагретого до комнатной температуры, чтобы выполнить лизис эритроцитов при комнатной температуре в течение четырех минут. Погасите реакцию пятью миллилитрами клеточной среды NIT-1 на пять миллилитров лизирующего буфера и пропустите клеточную суспензию в 50-миллилитровую центрифужную пробирку через свежее ситечко для удаления комков. Открутите тюбик при 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем ресуспендируйте гранулу ячейки в 20 миллилитрах PBS перед подсчетом клеток. После подсчета открутите ячейки при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточный гранул в стерильном PBS в 1,5-миллилитровой реакционной пробирке с безопасным замком.
Либо сделайте инъекцию немедленно, либо храните клетки на льду не более одного часа. Разогрейте тело взрослых мышей-реципиентов NOD SCID, используя тепловую лампу в течение пяти-10 минут, чтобы вазодилатировать вены. Ресуспендируйте раствор спленоцитов перед каждой инъекцией.
Для каждой мыши наберите в шприц 100 микролитров предварительно подогретой суспензии спленоцитов, убедитесь, что нет пузырьков воздуха. Затем поместите мышь в удерживающее устройство, прежде чем захватить ее хвост недоминантной рукой. Найдите одну из двух боковых хвостовых жилок.
При необходимости аккуратно поверните хвост. Протрите хвост дезинфицирующей салфеткой, содержащей 70% изопропилового спирта. Доминирующей рукой введите иглу под острым углом в центральную область хвоста.
Скос иглы вверх проведите иглой на несколько миллиметров по коже. Затем слегка надавите на шприц, чтобы ввести суспензию спленоцитов. Не позволяйте игле двигаться дальше внутрь или наружу во время инъекции.
Успешные инъекции не вызывают противодавления во время инъекции и обозначаются прозрачным или белым кровотоком сразу после инъекции. После инъекции осторожно выпустите иглу из вены и слегка надавите на хвост дезинфицирующей салфеткой до тех пор, пока кровотечение не остановится. Освободите мышь от удерживающего устройства и аккуратно перенесите ее в только что подготовленную клетку.
По крайней мере, за пять минут до визуализации введите мыши внутрибрюшинно соответствующую дозировку раствора D-люциферина, используя шприц объемом один миллилитр и иглу 26-го калибра. После входа в программное обеспечение для работы с изображениями на панели управления выберите «Инициализировать». Чтобы автоматически сохранить данные изображения, нажмите «Получение», а затем «Автосохранение в» и создайте соответствующие папки на компьютере.
После того, как прибор завершит инициализацию, установите время экспозиции равным одной минуте. Поместите мышь на прибор визуализации в положение лежа с растопыренными конечностями и направьте голову в носовой конус. Аккуратно расплющите мышь, нажав на центр ее спины обеими руками, а затем разведя руки наружу и в стороны.
Затем в программном обеспечении для обработки изображений выберите «Получить и записать все соответствующие детали эксперимента» во всплывающем окне. У двух из трех изученных мышей контрольный трансплантат был разрушен к 18-му дню, о чем свидетельствует потеря соответствующих биолюминесцентных сигналов. У другой мыши, однако, мутантный трансплантат был разрушен, в то время как контрольный трансплантат выжил, что подчеркивает биологическую изменчивость между животными.
Биолюминесцентный сигнал был количественно определен, и выживаемость трансплантата была представлена как процент остаточного биолюминесцентного сигнала по сравнению с сигналом в первый момент времени. Соотношение люминесцентных сигналов от мутантного трансплантата к контрольному трансплантату для каждой мыши использовалось для визуализации различий между животными. Перед переносом заболевания трансплантированные клетки могут реплицироваться, в результате чего через кожу видны расширенные трансплантаты.
При визуализации эти трансплантаты показали насыщенные биолюминесцентные сигналы, которые не могли быть точно определены. Трансплантаты могут быть выделены в различные моменты времени для характеристики инфильтрирующих иммунных клеток, например, с помощью проточной цитометрии для исследования механизмов аутоиммунной атаки и защиты трансплантата.
