Bu protokol, otoimmün ataklara karşı korunma mekanizmalarını anlamaya ve tip bir diyabette beta hücre replasmanı için terapötik hedefleri belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten düşük maliyet, hücre kültürü, nakil ve görüntüleme yöntemlerinin basitliği ve fare tekniklerinin minimal invazivliğidir. Daha önce hiç kuyruk damarı enjeksiyonu yapmamış kişiler, iğneyi damar içine sokmak için mücadele edebilir.
İlk enjeksiyonunuzdan önce bir uzman tarafından bir gösteri isteyin. Başlamak için, anestezi uygulanmış fareyi alın ve cildin yaklaşık bir inç x iki inçini açığa çıkaran bir koruyucu ile elektrikli tıraş makinesi kullanarak saçları sırt tarafından çıkarın. Tıraş olmuş fareyi yıkma odasına geri getirin.
Nakilden önce, her seferinde bir fareyi odadan izofluran burun konisi ile donatılmış temiz bir yüzeye aktarın ve farenin başını nazikçe burun konisine yönlendirin. Gevşek tüyleri gidermek ve cildi dezenfekte etmek için tıraş edilen bölgeyi izopropil alkol hazırlama pedi ile silin. Daha sonra, 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitre steril şırıngaya 300 mikrolitreden fazla hücre süspansiyonu çekin.
Şırıngadaki kabarcıkları çıkarın ve fazlalığı dışarı iterken 300 mikrolitre hücre süspansiyonunu koruyun. Baskın olmayan elde tutulan bir çift kavisli forseps kullanarak, deri altı boşluğa daha kolay erişim sağlamak için farenin sırtının bir tarafındaki cildi yavaşça kaldırın. Daha sonra baskın eli kullanarak, şırıngayı farenin vücudunun koronal ve sagital ovalarına paralel olarak konumlandırın.
İğne farenin kafasına doğru işaret ettiğinde, arka çeyreklerin yakınındaki cilde yerleştirin ve tüm iğnenin cildin altında kalmasını ve dürtmemesini sağlarken deri altı boşluğa yönlendirin. Forsepsleri, cildi iğnenin tabanının etrafında tutacak şekilde ayarlayın. Hücre süspansiyonunun 50 mikrolitreden daha azını yavaşça dağıtın ve enjeksiyon bölgesinde cildin altında küçük bir çıkıntı oluşumunu onaylayın.
Deri altından 200 mikrolitreye kadar hücre süspansiyonu enjekte etmeye devam edin. Daha sonra forsepsleri yerinde tutarak ve iğneyi farenin vücuduna paralel tutarak iğneyi geri çekin. İğne çıkarıldıktan sonra, hücrelerin delinme yarasından sızmasını önlemek için cildi birkaç saniye forseps ile kapalı tutun.
Nakli takiben, her fareyi yeni bir kafese aktarın ve kafese ek fareler eklemeden önce hayvanın anesteziden tamamen iyileşmesine izin verin. Ötanazi fareyi sırtına yerleştirerek, ciltte yaklaşık iki inç uzunluğunda dikey bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Farenin sağ tarafını kesin ve parlak kırmızı dalağı bulun.
Dalağı pembe pankreastan yavaşça kesin ve beş mililitre steril PBS içeren steril 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Dalağı steril bir şırınga pistonunun düz üst kısmı ile ezin. 50 mililitrelik bir konik tüpe 40 veya 70 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve beş mililitre PBS ile astarlayın.
Dalak süspansiyonunu süzgecin içine aktarın ve yavaşça ezin. Bulaşığı 10 mililitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı süzgecin üzerine aktarın. Süzgeçte kırmızı renk kalmayana kadar ezmeye devam edin.
Daha sonra tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G hızında döndürün ve kırmızı kan hücrelerinin oda sıcaklığında dört dakika boyunca parçalanmasını gerçekleştirmek için hücre peletini oda sıcaklığına önceden ısıtılmış beş mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edici bir pipetle çıkarın. Reaksiyonu, beş mililitre lizis tamponu başına beş mililitre NIT-1 hücre ortamı ile söndürün ve kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu taze bir süzgeçten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne geçirin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de döndürün.
Daha sonra, hücreleri saymadan önce hücre peletini 20 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de döndürün. Hücre peletini steril PBS'de 1,5 mililitrelik bir güvenli kilit reaksiyon tüpünde yeniden askıya alın.
Hemen enjekte edin veya hücreleri en fazla bir saat boyunca buz üzerinde saklayın. Damarları vazodilate etmek için yetişkin alıcı NOD SCID farelerinin vücudunu beş ila 10 dakika boyunca bir ısı lambası kullanarak ısıtın. Her enjeksiyondan önce splenosit çözeltisini tekrar askıya alın.
Her fare için, önceden ısıtılmış splenosit süspansiyonunun 100 mikrolitresini şırıngaya çekin, hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Ardından, kuyruğunu baskın olmayan elle yakalamadan önce fareyi kısıtlama cihazına yerleştirin. İki lateral kuyruk damarından birini bulun.
Gerekirse kuyruğu yavaşça döndürün. Kuyruğu% 70 izopropil alkol içeren bir dezenfeksiyon mendili ile silin. Baskın eli kullanarak, iğneyi kuyruğun orta bölgesine keskin bir açıyla yerleştirin.
İğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde, iğneyi cilt boyunca birkaç milimetre kaydırın. Daha sonra splenosit süspansiyonunu enjekte etmek için şırıngaya hafif basınç uygulayın. Enjeksiyon sırasında iğnenin daha fazla içeri veya dışarı hareket etmesine izin vermeyin.
Başarılı enjeksiyonlar enjeksiyon sırasında geri basınca neden olmaz ve enjeksiyondan hemen sonra şeffaf veya beyaz kan akışı ile gösterilir. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yavaşça damardan çıkarın ve kanama durana kadar bir dezenfeksiyon mendili ile kuyruğa hafif basınç uygulayın. Fareyi kısıtlama cihazından serbest bırakın ve yavaşça yeni hazırlanmış bir kafese aktarın.
Görüntülemeden en az beş dakika önce, fareye bir mililitrelik bir şırınga ve 26 gauge iğne kullanarak uygun dozda D-lusiferin çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Görüntüleme yazılımında oturum açtıktan sonra, kontrol panelinde başlat'ı seçin. Görüntüleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için, edinimin üzerine tıklayın ve ardından otomatik olarak kaydedin ve bilgisayarda uygun klasörleri oluşturun.
Cihaz başlatmayı bitirdiğinde, pozlama süresini bir dakikaya ayarlayın. Fareyi görüntüleme cihazının üzerine, uzuvları oynak olacak şekilde yüzüstü bir konuma getirin ve başını burun konisine yönlendirin. Fareyi sırtının ortasına iki elinizle bastırarak ve ardından ellerinizi dışa ve birbirinden ayırarak hafifçe düzleştirin.
Ardından, görüntüleme yazılımında, açılır pencerede denemenin ilgili ayrıntılarını al'ı seçin ve kaydedin. İncelenen üç fareden ikisinde, kontrol grefti, ilgili biyolüminesan sinyallerin kaybından açıkça görüldüğü gibi, 18. günde yok edildi. Bununla birlikte, diğer farede, kontrol grefti hayatta kalırken mutant greft yok edildi ve hayvanlar arasındaki biyolojik çeşitliliği vurguladı.
Biyolüminesan sinyal ölçüldü ve greft sağkalımı, ilk zaman noktasındaki sinyale kıyasla kalıntı biyolüminesan sinyalin yüzdesi olarak rapor edildi. Her fare için mutant greftten gelen ışıldayan sinyallerin kontrol greftine oranı, hayvanlar arasındaki varyasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hastalık transferinden önce, nakledilen hücreler çoğalabilir ve bu da deriden görülebilen genişlemiş greftlerle sonuçlanabilir.
Görüntüleme üzerine, bu greftler doğru bir şekilde ölçülemeyen doymuş biyolüminesan sinyaller gösterdi. Greftler, infiltrasyon yapan immün hücrelerin karakterizasyonu için çeşitli zaman noktalarında, örneğin otoimmün atak ve greft koruma mekanizmalarını araştırmak için akış sitometrisi ile izole edilebilir.
