Este protocolo puede ayudar a comprender los mecanismos de protección contra los ataques autoinmunes e identificar objetivos terapéuticos para el reemplazo de células beta en la diabetes tipo uno. La principal ventaja de esta técnica es el costo relativamente bajo, la simplicidad de los métodos de cultivo celular, trasplante e imagen, así como la mínima invasividad de las técnicas de ratón. Las personas que nunca han realizado una inyección en la vena de la cola antes pueden tener dificultades para insertar la aguja en la vena.
Solicite una demostración por un experto antes de su primera inyección. Para comenzar, tome el ratón anestesiado y retire el vello de su lado dorsal usando una afeitadora eléctrica con un protector, exponiendo aproximadamente una pulgada por dos pulgadas de la piel. Devuelva el ratón afeitado a la cámara de derribo.
Antes del trasplante, transfiera un ratón a la vez desde la cámara a una superficie limpia equipada con un cono nasal de isoflurano y guíe suavemente la cabeza del ratón hacia el cono de la nariz. Limpie el área afeitada con una almohadilla de preparación de alcohol isopropílico para eliminar el vello suelto y desinfectar la piel. A continuación, extraiga más de 300 microlitros de suspensión celular en una jeringa estéril de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26.
Retire cualquier burbuja de la jeringa y retenga 300 microlitros de suspensión celular mientras empuja el exceso. Usando un par de pinzas curvas sostenidas en la mano no dominante, levante suavemente la piel de un lado de la espalda del ratón para permitir un acceso más fácil al espacio subcutáneo. Luego, usando la mano dominante, coloque la jeringa paralela a las llanuras coronal y sagital del cuerpo del ratón.
Con la aguja apuntando hacia la cabeza del ratón, insértela en la piel cerca de los cuartos traseros y guíela hacia el espacio subcutáneo mientras se asegura de que toda la aguja permanezca debajo de la piel y no se apodere de ella. Ajuste los fórceps para sujetar la piel alrededor de la base de la aguja. Dispense lentamente menos de 50 microlitros de la suspensión celular y confirme la formación de una pequeña protuberancia debajo de la piel en el sitio de la inyección.
Continuar inyectando hasta 200 microlitros de la suspensión celular por vía subcutánea. Luego, sosteniendo las pinzas en su lugar y manteniendo la aguja paralela al cuerpo del ratón, retire la aguja. Una vez que se retira la aguja, mantenga la piel cerrada con fórceps durante unos segundos para evitar que las células se escapen de la herida punzante.
Después del trasplante, transfiera cada ratón a una jaula nueva y permita que el animal se recupere completamente de la anestesia antes de agregar ratones adicionales a la jaula. Colocando el ratón sacrificado en su espalda, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión vertical de aproximadamente dos pulgadas de largo en la piel. Abra el lado derecho del mouse y localice el bazo rojo brillante.
Corte suavemente el bazo lejos del páncreas rosado y transfiéralo a una placa de Petri estéril de 10 centímetros que contenga cinco mililitros de PBS estéril. Triture el bazo con la parte superior plana de un émbolo de jeringa estéril. Coloque un colador de 40 o 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros y ceblo con cinco mililitros de PBS.
Transfiera la suspensión del bazo al colador y macháquela suavemente. Lave el plato con 10 mililitros de PBS y transfiera el lavado al colador. Continúe machacando hasta que no quede ningún color rojo en el colador.
Luego gire el tubo a una velocidad de 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante con una pipeta aspiradora antes de resuspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis ACK precalentado a temperatura ambiente para realizar la lisis de los glóbulos rojos a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Apague la reacción con cinco mililitros de medios celulares NIT-1 por cada cinco mililitros de tampón de lisis y pase la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 mililitros a través de un filtro nuevo para eliminar los grumos. Gire el tubo a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, resuspenda el pellet de células en 20 mililitros de PBS antes de contar las células. Después de contar, gire las celdas a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Resuspenda el pellet celular en PBS estéril en un tubo de reacción de bloqueo seguro de 1,5 mililitros.
Inyecte inmediatamente o almacene las células en hielo durante un máximo de una hora. Caliente el cuerpo de los ratones adultos receptores NOD SCID usando una lámpara de calor durante cinco a 10 minutos para vasodilatar las venas. Vuelva a suspender la solución de esplenocitos antes de cada inyección.
Para cada ratón, extraiga 100 microlitros de la suspensión de esplenocitos precalentada en la jeringa, asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes. A continuación, coloque el mouse en el dispositivo de sujeción antes de capturar su cola con la mano no dominante. Localice una de las dos venas laterales de la cola.
Gire suavemente la cola si es necesario. Limpie la cola con una toallita desinfectante que contenga 70% de alcohol isopropílico. Usando la mano dominante, inserte la aguja en un ángulo agudo en la región central de la cola.
Con el bisel de la aguja hacia arriba, deslice la aguja unos milímetros a través de la piel. Luego aplique una presión suave a la jeringa para inyectar la suspensión de esplenocitos. No permita que la aguja se mueva más hacia adentro o hacia afuera cuando se inyecta.
Las inyecciones exitosas no dan lugar a contrapresión durante la inyección y están indicadas por un flujo sanguíneo transparente o blanco inmediatamente después de la inyección. Después de la inyección, suelte suavemente la aguja fuera de la vena y aplique una ligera presión en la cola con una toallita desinfectante hasta que se detenga el sangrado. Suelte el ratón del dispositivo de sujeción y transfiéralo suavemente a una jaula recién preparada.
Al menos cinco minutos antes de la toma de imágenes, inyecte al ratón por vía intraperitoneal con la dosis adecuada de solución de D-luciferina con una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 26. Después de iniciar sesión en el software de imágenes, en el panel de control, seleccione inicializar. Para guardar automáticamente los datos de imágenes, haga clic en adquisición seguido de guardado automático y cree las carpetas apropiadas en la computadora.
Una vez que el instrumento haya terminado de inicializarse, establezca el tiempo de exposición en un minuto. Coloque el ratón sobre el instrumento de imagen en posición prona con las extremidades extendidas y guíe su cabeza hacia el cono de la nariz. Aplana el ratón suavemente presionando el centro de su espalda con ambas manos y luego extendiendo las manos hacia afuera y separadas.
Luego, en el software de imágenes, seleccione adquirir y registre cualquier detalle relevante del experimento en la ventana emergente. En dos de los tres ratones estudiados, el injerto de control fue destruido en el día 18, como lo demuestra la pérdida de las respectivas señales bioluminiscentes. En el otro ratón, sin embargo, el injerto mutante fue destruido mientras que el injerto de control sobrevivió, destacando la variación biológica entre los animales.
Se cuantificó la señal bioluminiscente y la supervivencia del injerto se informó como el porcentaje de la señal bioluminiscente residual en comparación con la señal en el primer punto de tiempo. La relación de señales luminiscentes del injerto mutante al injerto de control para cada ratón se utilizó para visualizar la variación entre animales. Antes de la transferencia de la enfermedad, las células trasplantadas pueden replicarse, lo que resulta en injertos expandidos visibles a través de la piel.
Tras la obtención de imágenes, estos injertos mostraron señales bioluminiscentes saturadas que no pudieron cuantificarse con precisión. Los injertos pueden aislarse en varios puntos de tiempo para la caracterización de las células inmunes infiltrantes, por ejemplo, citometría de flujo para investigar los mecanismos de ataque autoinmune y protección del injerto.
