Notchシグナル伝達は、後生動物の発生中の硫酸塩の決定とパターン化を制御します。我々は、ノッチリガンドδDを標識し、発達中のゼブラフィッシュ前脳における放射状グリア前駆細胞におけるそのエンドサイトーシス輸送をイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しました。ゼブラフィッシュの隠れた脳室注射は、発達中の脳室を覆う筋腫性放射状グリア前駆細胞による選択的な抗Dld-Atto-647Nの取り込みを高効率で効果的に持続させます。
このプロトコルは、さまざまな発生段階で利用される他の薬理学的または遺伝的摂動と簡単に組み合わせることができ、成人の脳やヒト多能性幹細胞由来の2Dまたは3D脳オルガノイドに適応できる可能性があります。受精胚を生成し、18〜20時間インキュベートした後、インキュベーターから取り出します。まず白色光を用いて20倍の倍率で落射蛍光顕微鏡で観察する。
ガラスピペットを使用して顕微鏡下で曇っているか破裂しているように見える死んだ胚を捨てます。次に、蛍光灯をオンにして、顕微鏡のRFPフィルター設定を選択します。強い赤色蛍光の胚を選択し、卵水で新しい皿に移します。
次に、白色光の下で2つの細かい鉗子を使用して手動で胚を脱絨毛します。1対の鉗子で絨毛膜を保持し、もう一方の鉗子で絨毛膜を引き裂きます。鉗子を使用して涙を慎重に開き、他の鉗子の先端で胚をそっと押して、胚が通過するのに十分な大きさにします。
脱コリオン化した胚を新鮮な胚培地を入れた新しいペトリ皿に移し、マイクロインジェクションの前に素早くすすぎます。プラーで細い注射針を引っ張った後、実体解剖顕微鏡で鉗子で針の先端を開きます。先端の直径を約10マイクロメートル、テーパー角度を約30度にします。
次に、0.5マイクロリットルの抗DLD抗体と2マイクロリットルの抗マウスLG Atto-647N抗体を5〜10回ピペッティングして混合し、それらをコンジュゲートし、室温で少なくとも30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、2.5マイクロリットルのブロッキングバッファーと0.5マイクロリットルの0.5%フェノールレッドを抗体混合物に加え、ピペッティングによって混合して、混合物に残っている非結合抗体をブロックします。次に、胚培地に1%低融点アガロースを調製する。
アガロースを含む混合物を摂氏70度で透明になるまで加熱します。アガロース溶液を分注した後、摂氏40度のヒートブロックに保管します。1%低融点アガロースを含むチューブで胚を3秒間すすぎます。
個々のアガロース滴を入れた逆さのプラスチック製ペトリ皿の蓋に胚を置き、各胚を別々にマウントします。胚をアガロースに横方向に平らに置き、アガロースが室温で固まるまでこの位置を維持します。アガロースにマウントされたすべての胚を卵培地で覆います。
埋め込まれた胚を実体顕微鏡の下に置き、アガロースを卵水で覆います。空気圧インジェクターをマイクロマニピュレーターでセットし、顕微鏡の近くに置きます。空気資源として高圧下で気体窒素を含む鋼製ガスボンベを使用してください。
胚がアガロースに取り付けられたら、ガスバルブを開きます。マイクロインジェクターのフロントフィルモジュールを使用しながら、準備したガラス針に2マイクロリットルの抗体混合物をマイクロマニピュレーターにフロントロードします。次に、入力圧力を80〜90ポンド/平方インチに調整し、射出圧力を20ポンド/平方インチに調整します。
顕微鏡下でマイクロメーターを使用して注入量を校正します。針の開口部のサイズに応じて、10〜120ミリ秒の範囲で調整時間を設定します。パドルをタップして各注入パルスを送り、各注入の注入量を4〜5ナノリットルに調整します。
次に、マイクロ注射針の先端を後脳の背側屋根板に突き刺し、ロンジミアゼロワンヒンジポイントの後方にあり、脳組織に当たることなく約10ナノリットルの抗体混合物を注入します。脳室内の赤い体液の流れを観察した。注入後、マイクロマニピュレーターのつまみを回して胚から針先を素早く外します。
注射を成功させるために、注入された混合物の赤い染料は、周囲のアガロースに漏れることなく安定して脳室に残ります。顕微鏡下でマウントプレートを移動して、別のマウントされた胚を反復に適した位置に配置します。6〜8個の胚を注入した後、顕微手術用ナイフでアガロースをはがし、埋め込まれたアガロースから胚を放出します。
マイクロ注入した胚を30ミリリットルの胚培地を入れた新鮮な皿に移し、次のステップのために室温に置きます。30分後、選択した胚を10ミリリットルの胚培地に移します。胚をマウントするには、チューブ内に同じ濃度のトリカンを含む0.8%低融点アガロースを準備します。
ガラスピペットを使用して、注入した胚を温かいアガロースに3秒間浸します。次に、直ちに同じガラスピペットでアガロースから胚を取り出し、チューブからアガロースを一滴入れて35ミリメートルのガラス底培養皿の中央に胚を置きます。ファイバープローブまたはローディングチップで胚を穏やかに向け、胚脳の背側をガラス底にできるだけ近づけます。
胚の位置を穏やかに回して、アガロースが徐々に固まるにつれて、カールせずに胚を伸ばします。その後、ガラス底皿を裏返して胚の位置を確認します。正しく取り付けられた胚を持つ背側前脳全体が顕微鏡で見ることができることを確認してください。
胚を覆うために、トリケインを含む摂氏28.5度の予熱胚培地を2〜3ミリリットル加えます。共焦点顕微鏡の温度制御されたステージに皿を適切に置き、イメージングチャンバーの温度を摂氏28.5度に調整します。これで、胚をイメージングする準備が整いました。
Atto-647Nを注入した胚は、脳室にバックグラウンド蛍光を示しました。抗Dld-Atto-647Nを注入したゼブラフィッシュ胚は、発達中の前脳のほとんどの細胞に大量の内在化蛍光粒子を示しました。タイムラプスイメージングは、細胞分裂中の細胞内抗Dld-Atto-647Nエンドソームの動きを示した。
ほとんどの有糸分裂放射状グリア前駆細胞は、抗Dld-Atto-647Nエンドソームの2つの娘細胞への前後の非対称分離を示しました。非対称性は後期の終わりに向かって安定し、その後娘細胞によるノッチシグナル伝達エンドソームの不斉遺伝をもたらした。針が適切な場所で隠されたブランドの心室に入れられていることを確認し、マイクロインジェクション後に漏れがないかどうかを確認します。
ノッチデルタシグナル伝達の標識に加えて、このプロトコルは、細胞外ドメインに対する良好な抗体が利用可能である場合、同様の戦略を使用して他の膜タンパク質または細胞外タンパク質を標識するために適用できます。
