ATAC-seqは、遺伝子発現調節機構を理解するための強力な技術です。しかし、脂肪組織は、脂質含有量が多く、ミトコンドリア汚染が高く、細胞の不均一性があるため、この技術を使用することは困難です。このプロトコルでは、蛍光活性化核ソーティングを使用して脂肪細胞特異的ATACシーケンシングを実行し、ミトコンドリアDNA汚染を最小限に抑えて高品質のデータを生成します。
この方法は、核標識トランスジェニックレポーター株を有する細胞型特異的Creマウス株が利用可能な他の組織においても使用することができる。核の分離は、サンプルごとに1つのガラスDounceで氷上でガラスDounceホモジナイザーを冷やすことから始めます。次に、各ガラスのダウンスに7ミリリットルのNPBミックスを追加します。
次に、50〜100ミリグラムの凍結脂肪組織をグラスDounceに入れ、長いハサミを使用していくつかの小さな断片に切ります。すべてのサンプルについて緩い乳棒で10回ストロークし、次にタイトな乳棒で10回ストロークします。内容物を100マイクロメートルのストレーナーで新しい50ミリリットルのチューブにろ過してから、ろ過したホモジネートを遠心分離用の15ミリリットルのチューブに移します。
上清を除去した後、穏やかに、しかし徹底的に指で叩いてペレットを500マイクロリットルのPBS-Nに再懸濁します。次に、懸濁液を40マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過し、250マイクロリットルのPBS-Nでストレーナーをすすぎます。ろ過した核懸濁液を、マイクロピペットを使用して蛍光活性化セルソーティングまたはFACSチューブに移します。
新しい1.5ミリリットルのチューブに500マイクロリットルのPBS-Nを加えて収集チューブを準備し、数回反転させてすべての内面をバッファーで濡らします。チューブを短時間回転させてすべての液体を降ろしてから、選別するまで氷の上に置きます。FACSの場合、シングレットにはFSC-A / FSC-Hゲーティングを使用し、大小の破片の除去にはFSC-A / SSC-Aを使用します。
mCherry/GFP陽性脂肪細胞核集団のためのゲート、および以前に準備された各収集チューブで10, 000核を採取する。選別後の核調製では、各収集チューブに500マイクロリットルのPBS-Nを加え、チューブを数回反転させて混合してから、収集チューブを200 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を完全に除去する。
25マイクロリットルのTn5マスター混合物を調製するには、12.5マイクロリットルの2xタグメンテーションDNAバッファーまたはTDバッファー、1.25マイクロリットルのTn5トランスポザーゼまたはTDE I酵素、および11.25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を混合します。次に、25マイクロリットルのTn5マスター混合物を各核ペレットに加え、穏やかなピペッティングによって再懸濁します。サーマルミキサーを使用して、摂氏37度で30分間600RPMでインキュベートします。
25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を25マイクロリットルのTn5核再懸濁液の混合物に加え、最終容量を50マイクロリットルにします。次に、pH 5.2のバッファーPB250マイクロリットルと3 M酢酸ナトリウム5マイクロリットルを加えます。混合物を参照キットに付属のカラムに移した後、室温で1分間17, 900 Gで遠心分離します。
フロースルーを廃棄した後、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。無水エタノールを含む750マイクロリットルのバッファーPEをチューブに加えます。カラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。
チューブを遠心分離し、フロースルーで収集チューブを廃棄します。転置されたDNA断片を増幅するには、固有のAd2を追加せずにPCRマスター混合物を調製します。nバーコードプライマー。
PCRを実行します。定量 PCR または qPCR を実行します。増幅曲線を確認し、最大値の約35%に達したサイクル数を推定することにより、必要な追加のPCRサイクル数を特定します。
計算を使用して、残りの 45 マイクロリットルの PCR 反応に対して PCR を実行します。前述の手順を使用して、増幅されたDNA断片を20マイクロリットルのバッファーEBで溶出します。溶出したDNAを新しいPCRチューブに移し、80マイクロリットルのバッファーEBを加えて容量を100マイクロリットルに調整します。次に、55マイクロリットルのSPRIビーズを加え、ピペッティングで混合します。室温で5分間インキュベートした後、ミニ磁気スタンド上で5分間分離します。
完了したら、150マイクロリットルの上清を新しいPCRチューブに移し、95マイクロリットルのSPRIビーズを加え、ピペッティングで混合します。ミニ磁気スタンドでビーズを分離する前に、反応物を5分間インキュベートします。上清を注意深く捨て、200マイクロリットルの70%エタノールを使用してビーズを1分間洗浄します。
さらに2回の洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、チューブを1000 Gで1分間遠心分離します。残りのエタノールをピペットで取り出し、蓋を開けた状態でPCRマシンでペレットを摂氏37度で2分間乾燥させます。
乾燥したら、ピペッティングによりペレットを20マイクロリットルのバッファーEBに再懸濁し、室温で5分間チューブをインキュベートします。ミニ磁気スタンドでビーズを5分間分離してから、最終ライブラリを含む上清18マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。mCherry標識およびGFP標識脂肪細胞核は、Adipoq-NuTRAPマウスの脂肪組織から単離された他の細胞型核と区別できた。
脂肪デポーの種類にもよりますが、脂肪細胞画分ではeWATで約50%、iWATで約30%、BATで65%の差が観察されました。15回以上のPCRサイクルを必要とするサンプルは、低品質のサンプルを示しました。ATAC-seqライブラリのサイズ分布解析では、ヌクレオソームフリー領域(NFR)に対応する複数のピークと、平均サイズが約500〜800塩基対のモノ、ジ、およびマルチヌクレオソームが示されました。
質の悪いサンプルは、通常、ヌクレオソームピークがないかほとんどない、またはほとんどないNFRを示しました。qRT-PCR解析による品質チェック試験では、Adipoq、Fabp4、Plin1、Pnpla2などの脂肪細胞マーカー遺伝子の近くの陽性ゲノム要素で10〜20倍の濃縮が示されましたが、陰性対照では濃縮は示されませんでした。熱発生遺伝子Ucp1による富化は、BATにおいて特異的に観察された。
ミトコンドリアリードは2%未満であり、ピークの下の画分は約18%から44%であり、すべての脂肪デポからのAdipoq、Fabp4、Plin1などの脂肪細胞マーカー遺伝子の近くに、高いS/N比を持つ複数の強いピークが明らかになりました。BATサンプル中の褐色脂肪細胞マーカーUcp1遺伝子座に強いATAC-seqピークが観察された。このプロトコルの最も重要な要素は、核の品質です。
高品質の組織サンプルを使用し、実験全体を通して、特に遠心分離および選別後の再懸濁中に核を穏やかに取り扱うことが重要です。このプロトコルは、核標識を施したトランスジェニックレポーターマウスに依存していることを覚えておくことが重要です。ここではNuTRAPマウスを用いたが、任意の同様の系を使用することができる。
当社のFACSデータを使用すると、計算多重解析を実行して、生物学的環境で遺伝子発現を調節する主要なトランスクリプトーム因子を見つけることができます。
