ATAC-seq هي تقنية قوية لفهم آليات تنظيم التعبير الجيني. ومع ذلك ، يصعب استخدام الأنسجة الدهنية باستخدام هذه التقنية بسبب محتوياتها الدهنية الكبيرة ، وتلوث الميتوكوندريا العالي ، وعدم التجانس الخلوي. في هذا البروتوكول ، تم إجراء تسلسل ATAC الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة المنشط بالفلورة ، والذي يولد بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي للميتوكوندريا.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في الأنسجة الأخرى حيث تتوفر خطوط فأر Cre الخاصة بنوع الخلية مع خطوط مراسل معدلة وراثيا لوضع العلامات النووية. ابدأ عزل النواة عن طريق تبريد الزجاج Dounce المجانسات على الجليد بكوب واحد Dounce لكل عينة. ثم أضف 7 ملليلتر من مزيج NPB إلى كل كوب ترتد.
ثم ضع 50 إلى 100 ملليغرام من الأنسجة الدهنية المجمدة في كوب Dounce ، وقم بتقطيعها إلى بضع قطع أصغر باستخدام مقص طويل. السكتة الدماغية 10 مرات مع مدقة فضفاضة لجميع العينات ، ثم 10 مرات مع مدقة ضيقة. قم بتصفية المحتوى من خلال مصفاة 100 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر قبل نقل التجانسات المفلترة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي.
بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS-N عن طريق النقر بالأصابع بلطف ولكن شامل. بعد ذلك ، قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 ملليلتر وشطف المصفاة ب 250 ميكرولتر من PBS-N. انقل المعلق النووي المرشح إلى فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو أنبوب FACS باستخدام ماصة ميكروية.
قم بإعداد أنبوب التجميع بإضافة 500 ميكرولتر من PBS-N إلى الأنبوب الجديد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بقلبه عدة مرات لتبليل جميع الأسطح الداخلية بالمخزن المؤقت. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لإسقاط كل السائل قبل وضعها على الجليد حتى الفرز. بالنسبة ل FACS ، استخدم بوابة FSC-A / FSC-H للمفردات الفردية و FSC-A / SSC-A لإزالة الحطام الصغير أو الكبير.
بوابة لسكان نواة الخلايا الشحمية الإيجابية mCherry / GFP ، وجمع 10،000 نواة في كل أنبوب تجميع تم إعداده مسبقا. لإعداد نواة ما بعد الفرز ، أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى كل أنبوب تجميع واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات قبل الطرد المركزي لأنابيب التجميع عند 200 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تماما إزالة طاف.
لتحضير 25 ميكرولترا من الخليط الرئيسي Tn5 ، امزج 12.5 ميكرولترا من محلول الحمض النووي 2x أو المخزن المؤقت TD ، و 1.25 ميكرولتر من Tn5 transposase أو إنزيم TDE I ، و 11.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من خليط Tn5 الرئيسي إلى كل حبة نواة وأعد تعليقها عن طريق السحب اللطيف. احتضان عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام خلاط حراري.
أضف 25 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز إلى 25 ميكرولترا من خليط إعادة تعليق نواة Tn5 مما يجعل الحجم النهائي 50 ميكرولتر. ثم أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت PB و 5 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم مع الرقم الهيدروجيني 5.2. بعد نقل الخليط إلى عمود مزود بالمجموعة المشار إليها ، قم بطرده عند 17،900 جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من التدفق ، ضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت PE الذي يحتوي على الإيثانول المطلق إلى الأنبوب. قم بطرد العمود ، وتجاهل التدفق ، ثم ضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
جهاز طرد مركزي الأنبوب ، وتجاهل أنبوب التجميع مع التدفق. لتضخيم شظايا الحمض النووي المنقولة ، قم بإعداد الخليط الرئيسي PCR دون إضافة Ad2 فريد. n التمهيدي الترميز الشريطي.
قم بتشغيل PCR. قم بتشغيل PCR الكمي أو qPCR. تحقق من منحنيات التضخيم وحدد عدد دورات PCR الإضافية المطلوبة من خلال تقدير عدد الدورات التي وصلت إلى ما يقرب من 35٪ من الحد الأقصى.
استخدم الحسابات لتشغيل PCR لل 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل PCR. باستخدام الإجراءات السابقة ، قم بإزالة شظايا الحمض النووي المضخمة ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. انقل الحمض النووي المستخلص إلى أنبوب PCR جديد واضبط الحجم على 100 ميكرولتر بإضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. بعد ذلك ، أضف 55 ميكرولترا من حبات SPRI واخلطها عن طريق الماصة. بعد 5 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، افصلها على حامل مغناطيسي صغير لمدة 5 دقائق.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد ، وأضف 95 ميكرولترا من حبات SPRI ، واخلطها عن طريق الماصة. احتضان التفاعل لمدة 5 دقائق قبل فصل الخرز على الحامل المغناطيسي الصغير. تخلص من المادة الطافية بعناية واغسل الخرز لمدة 1 دقيقة باستخدام 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
كرر غسلتين أخريين. بعد الغسيل النهائي ، أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 1000 غرام لمدة 1 دقيقة. ماصة من الإيثانول المتبقية وتجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على جهاز PCR مع غطاء مفتوح.
بمجرد التجفيف ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت EB عن طريق سحب الأنبوب واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. افصل الخرزات لمدة 5 دقائق على الحامل المغناطيسي الصغير قبل نقل 18 ميكرولترا من المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة النهائية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. كانت نوى الخلايا الشحمية الموسومة بالكرز mCherry والموسومة ب GFP مميزة عن نوى أنواع الخلايا الأخرى المعزولة عن الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP.
اعتمادا على نوع المستودع الدهني ، يكون الفرق حوالي 50٪ في eWAT ، و 30٪ في iWAT ، و 65٪ في BAT في كسور الخلايا الشحمية. أشارت العينات التي تتطلب أكثر من 15 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى عينات منخفضة الجودة. أظهر تحليل توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq قمم متعددة تتوافق مع المنطقة الخالية من النيوكليوسومات ، أو NFR ، والنيوكليوسومات الأحادية والثنائية والمتعددة بمتوسط أحجام يتراوح بين 500 و 800 زوج أساسي تقريبا.
أظهرت العينات ذات الجودة الرديئة عادة في الغالب NFR مع عدم وجود قمم نووية أو عدد قليل منها. أظهرت اختبارات فحص الجودة التي أجراها تحليل qRT-PCR إثراء من 10 إلى 20 ضعفا بالعناصر الجينومية الإيجابية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 ، بينما لم يظهر أي إثراء مع التحكم السلبي. لوحظ التخصيب بالجين الحراري Ucp1 على وجه التحديد في BAT.
كانت قراءات الميتوكوندريا أقل من 2٪ وكان الكسر تحت القمم حوالي 18٪ إلى 44٪ تم الكشف عن قمم قوية متعددة ذات نسب إشارة إلى ضوضاء عالية بالقرب من جينات علامات الخلايا الدهنية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 من جميع المستودعات الدهنية. لوحظت قمم ATAC-seq قوية في موضع علامة الخلايا الدهنية البنية Ucp1 في عينة BAT. العامل الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هو جودة النواة.
من المهم استخدام عينات أنسجة عالية الجودة والتعامل مع النوى برفق طوال التجربة ، خاصة أثناء إعادة التعليق بعد الطرد المركزي والفرز. من المهم أن نتذكر أن هذا البروتوكول يعتمد على الفئران المراسل المعدلة وراثيا مع وضع العلامات النووية. تم استخدام الفئران NuTRAP هنا ، ولكن يمكن استخدام أي نظام مماثل.
باستخدام بيانات FACS الخاصة بنا ، يمكن للمرء إجراء تحليل حسابي متعدد للعثور على عوامل النسخ الرئيسية التي تنظم التعبير الجيني في البيئات البيولوجية.
