ATAC-seq — это мощный метод для понимания регуляторных механизмов экспрессии генов. Однако жировая ткань затруднена с помощью этого метода из-за большого содержания липидов, высокого митохондриального загрязнения и клеточной гетерогенности. В этом протоколе специфическое для адипоцитов ATAC-секвенирование проводилось с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядра, которая генерирует высококачественные данные с минимальным загрязнением митохондриальной ДНК.
Этот метод также может быть использован в других тканях, где доступны клеточные линии мышей Cre с трансгенными репортерными линиями с ядерной маркировкой. Начните выделение ядра с охлаждения стеклянных гомогенизаторов Dounce на льду с одним стаканом Dounce на образец. Затем добавьте 7 миллилитров смеси NPB в каждый стакан Dounce.
Затем поместите от 50 до 100 миллиграммов замороженной жировой ткани в стакан и разрежьте его на несколько более мелких кусочков с помощью длинных ножниц. Погладьте 10 раз рыхлым пестиком по всем образцам, а затем 10 раз тугим пестиком. Отфильтруйте содержимое через 100-микрометровый фильтр в новую 50-миллилитровую пробирку, а затем передайте отфильтрованные гомогенаты в 15-миллилитровую пробирку для центрифугирования.
После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS-N путем осторожного, но тщательного постукивания пальцами. Затем отфильтруйте суспензию через сетчатое фильтр 40 микрометров в 50-миллилитровую пробирку и промойте ситечко 250 микролитрами PBS-N. Перенесите отфильтрованную ядерную суспензию в активированную флуоресценцией сортировку клеток или пробирку FACS с помощью микропипетки.
Подготовьте пробирку для сбора, добавив 500 микролитров PBS-N в новую 1,5-миллилитровую пробирку, и переверните ее несколько раз, чтобы смочить все внутренние поверхности буфером. Коротко покрутите трубки, чтобы сбить всю жидкость, прежде чем поместить их на лед до сортировки. Для FACS используйте стробирование FSC-A/FSC-H для синглетов и FSC-A/SSC-A для удаления мелкого или крупного мусора.
Ворота для популяции mCherry/GFP-положительных ядер адипоцитов и соберите по 10 000 ядер в каждую подготовленную ранее пробирку для сбора. Для подготовки ядра после сортировки добавьте 500 микролитров PBS-N в каждую сборную пробирку и перемешайте ее, несколько раз перевернув пробирку перед центрифугированием сборных пробирок при 200 G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Полностью удалите надосадочную жидкость.
Чтобы приготовить 25 микролитров основной смеси Tn5, смешайте 12,5 микролитров 2-кратного буфера ДНК или буфера TD, 1,25 микролитра транспозазы Tn5 или фермента TDE I и 11,25 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте 25 микролитров основной смеси Tn5 к каждой грануле ядра и ресуспендируйте ее путем осторожного пипетирования. Инкубировать при 600 об/мин в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия с помощью термомиксера.
Добавьте 25 микролитров безнуклеазной воды к 25 микролитрам смеси ресуспендирования ядра Tn5, получив конечный объем 50 микролитров. Затем добавьте 250 микролитров буферного PB и 5 микролитров 3 М ацетата натрия с pH 5,2. После переноса смеси в колонку, поставляемую с указанным комплектом, центрифугируйте ее при температуре 17 900 G в течение 1 минуты при комнатной температуре.
После отбрасывания проточного отверстия поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубку. Добавьте в пробирку 750 микролитров буферного полиэтилена, содержащего абсолютный этанол. Центрифугируйте колонну, откажитесь от проточной части и поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубку.
Центрифугируйте пробирку и выбросьте сборную трубку с проточным отверстием. Чтобы амплификировать транспонированные фрагменты ДНК, приготовьте мастер-смесь для ПЦР без добавления уникального Ad2. Грунтовка для штрихкодирования.
Запустите ПЦР. Запустите количественную ПЦР или кПЦР. Проверьте кривые амплификации и определите количество необходимых дополнительных циклов ПЦР, оценив количество циклов, достигших примерно 35% от максимума.
Используйте расчеты для запуска ПЦР для оставшихся 45 микролитров реакции ПЦР. Используя более ранние процедуры, разбавляют амплифицированные фрагменты ДНК 20 микролитрами буфера EB. Перенесите элюированную ДНК в новую ПЦР-пробирку и отрегулируйте объем до 100 микролитров, добавив 80 микролитров буфера EB. Затем добавьте 55 микролитров шариков SPRI и перемешайте пипеткой. После 5 минут инкубации при комнатной температуре отделите его на мини-магнитной подставке на 5 минут.
После этого перенесите 150 микролитров надосадочной жидкости в новую ПЦР-пробирку, добавьте 95 микролитров шариков SPRI и перемешайте пипеткой. Инкубируйте реакцию в течение 5 минут, прежде чем отделять шарики на мини-магнитной подставке. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость и вымойте шарики в течение 1 минуты, используя 200 микролитров 70% этанола.
Повторите еще две стирки. После окончательной промывки центрифугируйте пробирки при 1000 г в течение 1 минуты. Вылейте оставшийся этанол пипеткой и высушите гранулы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 минут на ПЦР-машине с открытой крышкой.
После высыхания ресуспендируют гранулы в 20 микролитрах буферного ЭБ путем пипетки и инкубируют пробирку в течение 5 минут при комнатной температуре. Отделите шарики в течение 5 минут на мини-магнитной подставке, прежде чем перенести 18 микролитров надосадочной жидкости, содержащей конечную библиотеку, в новую 1,5-миллилитровую пробирку. Ядра адипоцитов, меченные mCherry и GFP, отличались от ядер других типов клеток, выделенных из жировых тканей мыши Adipoq-NuTRAP.
В зависимости от типа жирового депо во фракциях адипоцитов наблюдалась разница примерно в 50% в eWAT, 30% в iWAT и 65% в BAT. Образцы, требующие более 15 циклов ПЦР, показали низкое качество образцов. Анализ распределения по размерам библиотек ATAC-seq продемонстрировал множественные пики, соответствующие безнуклеосомной области, или NFR, а также моно-, ди- и многонуклеосомам со средними размерами примерно от 500 до 800 пар оснований.
Образцы низкого качества обычно показывали в основном NFR без нуклеосомных пиков или с небольшим количеством нуклеосомных пиков. Тесты проверки качества с помощью анализа qRT-PCR показали 10-20-кратное обогащение положительными геномными элементами рядом с генами-маркерами адипоцитов, такими как Adipoq, Fabp4, Plin1 и Pnpla2, в то время как при отрицательном контроле обогащение не было показано. Обогащение термогенным геном Ucp1 наблюдалось специфически в BAT.
Показания митохондрий составляли менее 2%, а доля под пиками составляла примерно от 18% до 44%Множественные сильные пики с высоким отношением сигнал/шум были выявлены рядом с генами-маркерами адипоцитов, такими как Adipoq, Fabp4 и Plin1 из всех жировых депо. Сильные пики ATAC-seq наблюдались в локусе коричневого маркера адипоцитов Ucp1 в образце BAT. Наиболее важным фактором для этого протокола является качество ядра.
Важно использовать высококачественные образцы тканей и бережно обращаться с ядрами на протяжении всего эксперимента, особенно во время ресуспендирования после центрифугирования и сортировки. Важно помнить, что этот протокол основан на трансгенных репортерных мышах с ядерной маркировкой. Здесь использовались мыши NuTRAP, но можно использовать любую подобную систему.
С помощью наших данных FACS можно выполнить вычислительный множественный анализ, чтобы найти ключевые транскриптомные факторы, которые регулируют экспрессию генов в биологических условиях.
