ATAC-seq è una tecnica potente per comprendere i meccanismi di regolazione dell'espressione genica. Tuttavia, il tessuto adiposo è difficile da usare questa tecnica a causa del suo grande contenuto lipidico, dell'elevata contaminazione mitocondriale e dell'eterogeneità cellulare. In questo protocollo, il sequenziamento ATAC specifico per gli adipociti è stato eseguito utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza, che genera dati di alta qualità con una contaminazione minima del DNA mitocondriale.
Questo metodo può essere utilizzato anche in altri tessuti in cui sono disponibili linee di topi Cre specifiche per tipo di cellula con linee di reporter transgeniche di etichettatura nucleare. Iniziare l'isolamento del nucleo raffreddando gli omogeneizzatori Dounce in vetro su ghiaccio con un Dounce di vetro per campione. Quindi, aggiungere 7 millilitri di miscela NPB a ciascun bicchiere Dounce.
Quindi, posizionare da 50 a 100 milligrammi di tessuto adiposo congelato nel Dounce di vetro e tagliarlo in alcuni pezzi più piccoli usando un lungo paio di forbici. Colpisci 10 volte con un pestello sciolto per tutti i campioni, e poi 10 volte con un pestello stretto. Filtrare il contenuto attraverso un filtro da 100 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri prima di trasferire gli omogenati filtrati in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS-N picchiettando delicatamente ma accuratamente. Quindi, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri in un tubo da 50 millilitri e sciacquare il filtro con 250 microlitri di PBS-N. Trasferire la sospensione nucleare filtrata in una selezione cellulare attivata a fluorescenza o in un tubo FACS utilizzando una micropipetta.
Preparare il tubo di raccolta aggiungendo 500 microlitri di PBS-N al nuovo tubo da 1,5 millilitri e capovolgerlo alcune volte per bagnare tutte le superfici interne con il tampone. Ruotare brevemente i tubi per far scendere tutto il liquido prima di metterli sul ghiaccio fino alla cernita. Per FACS, utilizzare il gating FSC-A/FSC-H per singolette e FSC-A/SSC-A per la rimozione di detriti piccoli o grandi.
Gate per la popolazione di nuclei adipocitari mCherry/GFP-positivi e raccogliere 10.000 nuclei in ogni provetta di raccolta preparata in precedenza. Per la preparazione del nucleo post-selezione, aggiungere 500 microlitri di PBS-N a ciascuna provetta di raccolta e mescolarla capovolgendo alcune volte la provetta prima di centrifugare le provette di raccolta a 200 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere completamente il surnatante.
Per preparare 25 microlitri di miscela principale Tn5, mescolare 12,5 microlitri di tampone DNA di tagmentazione 2x o tampone TD, 1,25 microlitri di trasposasi Tn5 o enzima TDE I e 11,25 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere 25 microlitri di miscela principale Tn5 a ciascun pellet di nucleo e risospenderlo mediante pipettaggio delicato. Incubare a 600 RPM per 30 minuti a 37 gradi Celsius utilizzando un miscelatore termico.
Aggiungere 25 microlitri di acqua priva di nucleasi ai 25 microlitri della miscela di risospensione del nucleo Tn5 ottenendo il volume finale di 50 microlitri. Quindi, aggiungere 250 microlitri di tampone PB e 5 microlitri di acetato di sodio 3 M con pH 5,2. Dopo aver trasferito la miscela in una colonna fornita con il kit di riferimento, centrifugarla a 17, 900 G per 1 minuto a temperatura ambiente.
Dopo aver eliminato il flusso passante, riposizionate una colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Aggiungere 750 microlitri di PE tampone contenente etanolo assoluto al tubo. Centrifugare la colonna, scartare il flusso e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.
Centrifugare il tubo e scartare il tubo di raccolta con il flowthrough. Per amplificare i frammenti di DNA trasposti, preparare la miscela master PCR senza aggiungere un Ad2 univoco. n primer per codici a barre.
Eseguire la PCR. Eseguire la PCR quantitativa o qPCR. Controllare le curve di amplificazione e identificare il numero di cicli PCR aggiuntivi necessari stimando il numero di cicli che hanno raggiunto circa il 35% del massimo.
Utilizzare i calcoli per eseguire la PCR per i restanti 45 microlitri della reazione PCR. Utilizzando le procedure precedenti, eluire i frammenti di DNA amplificati con 20 microlitri di tampone EB. Trasferire il DNA eluito in una nuova provetta PCR e regolare il volume a 100 microlitri aggiungendo 80 microlitri di EB tampone. Quindi, aggiungere 55 microlitri di perline SPRI e mescolare mediante pipettaggio. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, separarlo su un mini supporto magnetico per 5 minuti.
Una volta fatto, trasferire 150 microlitri di surnatante in una nuova provetta PCR, aggiungere 95 microlitri di perline SPRI e mescolare mediante pipettaggio. Incubare la reazione per 5 minuti prima di separare le perle sul mini supporto magnetico. Scartare accuratamente il surnatante e lavare le perline per 1 minuto utilizzando 200 microlitri di etanolo al 70%.
Ripeti altri due lavaggi. Dopo il lavaggio finale, centrifugare i tubi a 1000 G per 1 minuto. Pipettare l'etanolo rimanente e asciugare il pellet a 37 gradi Celsius per 2 minuti su una macchina PCR con il coperchio aperto.
Una volta essiccato, risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone EB mediante pipettaggio e incubare il tubo per 5 minuti a temperatura ambiente. Separare le perline per 5 minuti sul mini supporto magnetico prima di trasferire 18 microlitri del surnatante contenente la libreria finale in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. I nuclei adipocitari marcati con mCherry e GFP erano distinguibili dagli altri tipi di cellule isolati dai tessuti adiposi di un topo Adipoq-NuTRAP.
A seconda del tipo di deposito adiposo, la differenza è di circa il 50% in eWAT, il 30% in iWAT e il 65% in BAT sono stati osservati nelle frazioni adipocitarie. I campioni che richiedevano più di 15 cicli di PCR indicavano campioni di bassa qualità. L'analisi della distribuzione dimensionale delle librerie ATAC-seq ha dimostrato picchi multipli corrispondenti alla regione libera da nucleosomi, o NFR, e mono, di e multi-nucleosomi con dimensioni medie di circa 500-800 coppie di basi.
I campioni di scarsa qualità in genere mostravano per lo più NFR con nessun o pochi picchi nucleosomici. I test di controllo della qualità mediante l'analisi qRT-PCR hanno mostrato arricchimenti da 10 a 20 volte con gli elementi genomici positivi vicino ai geni marcatori degli adipociti come Adipoq, Fabp4, Plin1 e Pnpla2, mentre nessun arricchimento è stato mostrato con il controllo negativo. L'arricchimento con il gene termogenico Ucp1 è stato osservato specificamente in BAT.
Le letture mitocondriali erano inferiori al 2% e la frazione sotto i picchi era di circa il 18% al 44% Più picchi forti con alti rapporti segnale-rumore sono stati rivelati vicino a geni marcatori di adipociti come Adipoq, Fabp4 e Plin1 da tutti i depositi adiposi. Forti picchi di ATAC-seq sono stati osservati nel locus del marcatore adipocitario bruno Ucp1 nel campione di BAT. Il fattore più critico per questo protocollo è la qualità del nucleo.
È importante utilizzare campioni di tessuto di alta qualità e maneggiare delicatamente i nuclei durante l'esperimento, specialmente durante la risospensione dopo la centrifugazione e la selezione. È importante ricordare che questo protocollo si basa su topi reporter transgenici con etichettatura nucleare. Qui sono stati utilizzati topi NuTRAP, ma è possibile utilizzare qualsiasi sistema simile.
Con i nostri dati FACS, è possibile eseguire analisi multiple computazionali per trovare fattori trascrittomici chiave che regolano l'espressione genica in contesti biologici.
