ATAC-seq é uma técnica poderosa para entender os mecanismos regulatórios da expressão gênica. No entanto, o uso dessa técnica é dificultado pelo uso do tecido adiposo devido ao seu grande conteúdo lipídico, alta contaminação mitocondrial e heterogeneidade celular. Neste protocolo, o sequenciamento ATAC específico de adipócitos foi realizado usando a classificação nucleus ativada por fluorescência, que gera dados de alta qualidade com mínima contaminação do DNA mitocondrial.
Este método também pode ser usado em outros tecidos onde linhas de camundongos Cre específicas do tipo celular estão disponíveis com linhas de repórter transgênicas de marcação nuclear. Comece o isolamento do núcleo resfriando os homogeneizadores de vidro Dounce no gelo com um Dounce de vidro por amostra. Em seguida, adicione 7 mililitros da mistura de NPB a cada copo Dounce.
Em seguida, coloque de 50 a 100 miligramas de tecido adiposo congelado no vidro e corte-o em alguns pedaços menores usando uma tesoura longa. Golpeie 10 vezes com um pilão solto para todas as amostras e, em seguida, 10 vezes com um pilão apertado. Filtre o conteúdo através de um filtro de 100 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros antes de transferir os homogeneizados filtrados para um tubo de 15 mililitros para centrifugação.
Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS-N por meio de toques suaves, mas completos. Em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros e lave o filtro com 250 microlitros de PBS-N. Transfira a suspensão nuclear filtrada para um tubo de triagem de células ativadas por fluorescência ou FACS usando uma micropipeta.
Prepare o tubo de coleta adicionando 500 microlitros de PBS-N ao novo tubo de 1,5 mililitro e inverta-o algumas vezes para molhar todas as superfícies internas com o tampão. Gire brevemente os tubos para derrubar todo o líquido antes de colocá-los no gelo até a classificação. Para FACS, use o gating FSC-A/FSC-H para singlets e FSC-A/SSC-A para remoção de detritos pequenos ou grandes.
Portar para a população de núcleos de adipócitos mCherry/GFP-positivos, e coletar 10.000 núcleos em cada tubo de coleta preparado anteriormente. Para a preparação do núcleo pós-triagem, adicione 500 microlitros de PBS-N a cada tubo de coleta e misture-o invertendo o tubo algumas vezes antes de centrifugar os tubos de coleta a 200 G por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova completamente o sobrenadante.
Para preparar 25 microlitros de mistura mestre Tn5, misture 12,5 microlitros de tampão de DNA de marcação 2x ou tampão TD, 1,25 microlitros de enzima Tn5 transposase ou TDE I e 11,25 microlitros de água livre de nucleases. Em seguida, adicione 25 microlitros de mistura mestra de Tn5 a cada pelota de núcleo e ressuspenda-a por pipetagem suave. Incubar a 600 RPM durante 30 minutos a 37 graus Celsius utilizando um misturador térmico.
Adicionar 25 microlitros de água livre de nucleases aos 25 microlitros da mistura de ressuspensão do núcleo Tn5 perfazendo o volume final de 50 microlitros. Em seguida, adicionar 250 microlitros de tampão PB e 5 microlitros de acetato de sódio 3 M com pH 5,2. Depois de transferir a mistura para uma coluna fornecida com o kit referenciado, centrifuga-a a 17.900 G por 1 minuto à temperatura ambiente.
Depois de descartar o fluxo, coloque uma coluna giratória de volta no mesmo tubo de coleta. Adicionar 750 microlitros de PE tampão contendo etanol absoluto ao tubo. Centrifugar a coluna, descartar o fluxo e colocá-la de volta no mesmo tubo de coleta.
Centrifugar o tubo e descartar o tubo de coleta com o flowthrough. Para amplificar os fragmentos de DNA transpostos, prepare a mistura mestre de PCR sem adicionar um Ad2 exclusivo. n cartilha de código de barras.
Execute o PCR. Execute o PCR quantitativo ou qPCR. Verificar as curvas de amplificação e identificar o número de ciclos adicionais de PCR necessários, estimando o número de ciclos que atingiu aproximadamente 35% do máximo.
Use os cálculos para executar o PCR para os 45 microlitros restantes da reação de PCR. Usando os procedimentos anteriores, eluir os fragmentos de DNA amplificados com 20 microlitros de EB tampão. Transfira o DNA eluído para um novo tubo de PCR e ajuste o volume para 100 microlitros adicionando 80 microlitros de EB tampão. Em seguida, adicione 55 microlitros de contas SPRI e misture por pipetagem. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, separe-o em um mini suporte magnético por 5 minutos.
Uma vez feito, transfira 150 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de PCR, adicione 95 microlitros de contas SPRI e misture por pipetagem. Incubar a reação por 5 minutos antes de separar as contas no mini suporte magnético. Descarte o sobrenadante cuidadosamente e lave as contas por 1 minuto usando 200 microlitros de etanol 70%.
Repita mais duas lavagens. Após a lavagem final, centrifugar os tubos a 1000 G por 1 minuto. Pipetar o etanol restante e secar o pellet a 37 graus Celsius por 2 minutos em uma máquina de PCR com a tampa aberta.
Depois de seco, ressuspenda o pellet em 20 microlitros de tampão EB por pipetagem e incube o tubo por 5 minutos à temperatura ambiente. Separe as contas por 5 minutos no mini suporte magnético antes de transferir 18 microlitros do sobrenadante contendo a biblioteca final para um novo tubo de 1,5 mililitro. Os núcleos de adipócitos marcados com mCherry e GFP foram distinguíveis dos núcleos de outros tipos celulares isolados dos tecidos adiposos de um camundongo Adipoq-NuTRAP.
Dependendo do tipo de depósito adiposo, a diferença é de aproximadamente 50% no eTAB, 30% no iTAB e 65% no BAT foram observados nas frações de adipócitos. As amostras que necessitaram de mais de 15 ciclos de PCR indicaram amostras de baixa qualidade. A análise da distribuição de tamanho das bibliotecas ATAC-seq demonstrou múltiplos picos correspondentes à região livre de nucleossomos, ou NFR, e mono, di e multinucleossomos com tamanhos médios de aproximadamente 500 a 800 pares de bases.
Amostras de baixa qualidade tipicamente mostraram principalmente NFR com nenhum ou poucos picos nucleossomais. Os testes de verificação de qualidade pela análise de qRT-PCR mostraram enriquecimento de 10 a 20 vezes com os elementos genômicos positivos próximos a genes marcadores de adipócitos como Adipoq, Fabp4, Plin1 e Pnpla2, enquanto nenhum enriquecimento foi demonstrado com o controle negativo. O enriquecimento com o gene termogênico Ucp1 foi observado especificamente na BAT.
As leituras mitocondriais foram inferiores a 2% e a fração sob os picos foi de aproximadamente 18%a 44%Múltiplos picos fortes com altas relações sinal-ruído foram revelados próximos a genes marcadores de adipócitos como Adipoq, Fabp4 e Plin1 de todos os depósitos adiposos. Fortes picos de ATAC-seq foram observados no locus Ucp1 do marcador adipócito marrom na amostra de MTD. O fator mais crítico para esse protocolo é a qualidade do núcleo.
É importante usar amostras de tecido de alta qualidade e manusear suavemente os núcleos durante todo o experimento, especialmente durante a ressuspensão após centrifugação e classificação. É importante lembrar que esse protocolo se baseia em camundongos repórteres transgênicos com marcação nuclear. Camundongos NuTRAP foram usados aqui, mas qualquer sistema semelhante pode ser usado.
Com nossos dados FACS, pode-se realizar análise múltipla computacional para encontrar os principais fatores transcriptômicos que regulam a expressão gênica em ambientes biológicos.
