涙腺オルガノイドを使用すると、特定の遺伝子が涙腺の恒常性をどのように制御しているかを調べることができます。さらに、オルガノイドは再生医療にも使用できます。成体幹細胞由来の涙腺オルガノイド技術の主な利点は、健康で形質転換されていない涙腺上皮細胞の成長と研究を可能にすることです。
これらのオルガノイドは、最終的にはドライアイ疾患患者の治療に使用される可能性があります。実験に必要な培地と材料を準備することから始め、実験の前に消化培地のすべての成分を組み合わせることから始めます。この培地でメスを事前に濡らして、組織片がメスに付着しないようにします。
培地からマウスの涙腺組織を取り出し、それをペトリ皿に入れ、事前に湿らせたメスを使用してミンチします。組織片が0.5立方ミリメートル未満になったら、メスでペトリ皿からそれらをこすり落とし、消化媒体を含む15ミリリットルのチューブに移します。非常に小さな人間の生検の場合は、ミンチせずに消化培地に直接入れます。
組織片を有する15ミリリットルのチューブを摂氏37度の水浴中で最大15分間インキュベートする。それまでの間、炎の中でパスツールピペットチップを細くし、ベース培地で事前に湿らせます。解離プロセスを容易にするために、事前に湿らせて狭めたパスツールピペットで、ミンチ混合物を5分ごとに上下にピペットで行います。
顕微鏡下で多くの単一細胞と小さな塊が見える場合は、10ミリリットルのベース培地を加えて解離を停止します。400gで5分間スピンダウンした後、上清を除去し、ペレットを10ミリリットルのベース培地に再懸濁し、細胞にペレットダウンして洗浄を繰り返した。細かく刻んだ混合物を70マイクロメートルのストレーナーでろ過することにより、大きくて未消化の組織片と残りのコラーゲン繊維を取り除きます。
溶出液を400gで5分間回転させます。上清を除去した後、気泡を発生させずに、100マイクロリットルの冷たい細胞外マトリックス(ECM)に細胞ペレットを再懸濁し、単一のマウス涙腺の場合は50マイクロリットルの冷たいECMに、ヒト生検の場合は50マイクロリットルを再懸濁します。P200を使用して、12ウェル懸濁プレートのウェルあたり最大100マイクロリットルの細胞を播種し、ウェル内に約20マイクロリットルの液滴を作ります。
プレートを逆さまにして、摂氏37度の加湿インキュベーターに20〜30分間置き、ECMを固化させます。ECMが固まったら、12ウェルプレートのウェルあたり約1ミリリットルの室温マウス増殖培地を追加します。涙腺オルガノイドによる分泌を誘導する個々の成分を含む1ミリリットルのヒト分化培地を新たに調製する。
自動明視野タイムラプス顕微鏡で、プレート内で画像化する位置、5分の時間間隔、および4時間の持続時間を設定します。ECM液滴全体が各位置に表示されていることを確認します。イメージングを開始する前に、顕微鏡からプレートを動かさずにイメージングするウェルから培養液を取り出し、フォルスコリンやノルアドレナリンなどの化合物を含む、新しく調製した十分に再懸濁したヒト分化培地と交換します。
陰性対照として、分化培地をリフレッシュしたウェルが挙げられる。顕微鏡の実行ボタンをクリックし、4時間後に結果を分析します。本文に記載されているようにオルガノイドを解離した後、上清を廃棄します。
細胞を80マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。1.5ミリリットルのチューブで、実験に必要なプラスミドを調製します。プラスミドを細胞に加え、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
ポアリングパルスとトランスファーパルスのパラメータを使用してエレクトロポレーターをセットアップします。プラスミドを含む細胞をエレクトロポレーションキュベットに入れます。0.3アンペアから0.55アンペアの間の抵抗をすぐに測定し、すぐにエレクトロポレーションします。
完了したら、細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、Rhoキナーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーを追加します。細胞を室温で30分間回復させます。次に、細胞を500gで5分間ペレット化します。
上清を廃棄した後、細胞を200マイクロリットルのECMにプレートします。固化後、マウス膨張培地を追加します。オルガノイドの調製は、移植日の約3日前にヒト涙腺オルガノイドを分割します。
ECMからオルガノイドを抽出するには、培養液にディスパーゼを加えて最終濃度0.125単位/ミリリットルに到達し、P1000を使用してECM液滴を完全に再懸濁して破壊します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間戻します。オルガノイドを10ミリリットルのベース培地に再懸濁して、酵素を洗い流します。
細胞を400gで5分間ペレット化した後、5%ECMを添加した50マイクロリットルの低温ヒト増殖培地に再懸濁します。オルガノイド懸濁液を氷上に置き、直ちに移植に進む。マウスの同所性移植では、オルガノイド懸濁液をインスリン針で吸引します。
マウスが眠っているときは、主涙腺にアクセスできるようにすばやく横に置きます。5マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を皮膚から直接涙腺に注入します。マウスを回復させ、移植関連の不快感の存在を毎日、特に目に評価します。
マウスの涙腺の解剖に続いて、酵素的および機械的消化により、腺房および管を含む小さな組織断片が生成されました。マウス涙腺オルガノイド誘導に成功し、7日後に直径約500マイクロメートルの嚢胞性オルガノイドが見つかった。ヒト涙腺オルガノイドは3〜4日以内に嚢胞として成長し、組織分離後10〜14日で完全に成長したサイズに達しました。
分化培地中でそれぞれ5日後および7日後、マウスおよびヒトの涙腺オルガノイドはより密度が高くなった。サイクリックAMP活性化剤フォルスコリンまたは神経伝達物質ノルエピネフリンを適用すると、3時間以内にオルガノイドが腫れました。エレクトロポレーションが成功すると、ハイグロマイシンに耐性のあるオルガノイドが成長しました。
300マイクロメートルを超える成長中のオルガノイドクローンは、分化前にピックされました。ガイドRNAによって標的とされたPax6遺伝子座のPCR増幅は、選択されたすべてのクローンに対して367塩基対バンドをもたらした。配列決定した6個のうち1個のホモ接合型ノックアウトマウス涙腺クローンを、Pax6を標的とするガイドRNAを用いて得た。
一部のクローンは順調に成長しましたが、一部のオルガノイドクローンは摘み取った後に失われたり、分化し始めました。選ばれた10個のオルガノイドクローンのうち、7個は順調に成長しました。オルガノイドの生着は、マウス涙腺にオルガノイドを注入してから1ヶ月後に、ヒト特異的マーカーであるヒト核小体抗原について染色することにより確認した。
注意すべきことの1つは、組織やオルガノイドを過剰に消化しないことです。そうしないと、細胞が死滅する可能性があり、オルガノイドの確立率が低下します。涙腺オルガノイドは組織学によって分析することができます。
そうすることで、細胞組成の洞察を得ることができます。
