遺伝子座の機能不全は、パーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、双極性障害、不安などの神経学的および神経精神疾患に関与している。これらの役割を考えると、遺伝子座のコエルールスの分析は、その機能と機能不全を研究するために重要です。マウスの脳の切断中に、座のコレリウスは、その小さなサイズのために、コロナまたは矢状のセクションのいずれかで容易に見逃すことができます。
したがって、軌跡の局所化に関するガイダンスを提供するために、我々はいくつかのアプリケーションのためにマウスの脳内でこの領域を見つけるために開発したプロトコルを記述する。麻酔をかけたての脳を入れてから始め、50ミリリットルチューブの4%PFAにマウスを浸透させます。脳を摂氏4度で24時間インキュベートする。
鉗子を使用して、30%スクロース溶液の25ミリリットルで満たされた50ミリリットルの円錐管に脳を移す。脳がチューブの底に沈むまで48〜72時間摂氏4度でインキュベートします。脳幹セクションを埋め込むには、その切断面を埋め込み型の底に置き、脳幹を囲むように最適な切断温度化合物を追加します。
埋め込まれた脳をマイナス80度の冷凍庫で少なくとも12時間凍結し、さらに使用します。脳を持つ型をクライオスタットに入れ、数時間インキュベートして、その温度をクライオスタットの温度に合わせる。脳を含むOCTブロックを露出するには、カミソリの刃を使用して金型の4つのエッジを底まで切断し、そこから埋め込み型を剥がします。
カミソリの刃を使用してブロックの表面から過剰なOCTを取り除き、脳に触れないようにします。その後、クライオスタットのチャックにOCTブロックを取り付け、脳の切断面を前面に向かって露出させます。脳を調整するには、クライオスタットのカミソリの刃に平行にカット面を向けます。
標本を正しく向けるのは、このプロトコルの重要なステップです。脳の後ろ面の解剖学的特徴を用いて、小脳と下縁部の境界などのLCを見つけることが重要です。これは、適切にマウス脳スライサーマトリックスに脳を設定する上でケアを必要とします.
髄質から始まる脳をトリミング, ロストリアル100マイクロメートルのセクションを切断.小脳と脳幹が第4心室のレベルで1つの連続スライスとして切断し始めたら、50マイクロメートルの厚さのスライスを収集し始めます。各脳スライスを収集し、PBSで満たされた24ウェルプレートの井戸に入れるには、鉗子を使用します。
遺伝子座のコエリュラスは、小脳と下のコリカルがブレグマの約5.52ミリメートル後部でお互いに会うスライスで最も顕著になります。初日には、24ウェルプレートの脳スライスをPBSでそれぞれ5分間3回洗います。その後、洗剤で0.5%PBSを加え、摂氏4度で24時間透過させます。
翌日、スライスを0.5%PBSDで5分間3回洗浄します。その後、0.5%PBSDで1〜500の希釈で一次抗体を加え、摂氏4度で18時間インキュベートします。3日目にスライスを0.5%PBSDでそれぞれ10分間3回洗浄し、0.5%PBSDで1~1000の希釈で二次抗体を加えます。
プレートをアルミホイルで包み、摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、スライスを0.5%PBSDで5分間3回洗浄し、PBSで5分間洗浄します。DAPIを使用しないハードセットマウントメディアを使用してセクションをカバーします。
ガラスカバーで覆い、室温で30分間乾燥させます。次に、設定を備えた共焦点顕微鏡を使用して、適切な蛍光波長から画像脳スライスまでの信号を検出します。顕微鏡を脳スライスの焦点面に調整した後、10倍の倍率を使用して1枚の画像を撮ります。
小脳の下とポンと脳幹の上にある第4の心室を使用して、脳スライス内の可能なLC領域を見つける。第4心室の横縁に焦点を当て、LCは第4心室の端から始まり、ポンの脳幹領域を指し示す。LCで発現するタンパク質であるドーパミンβ-ヒドロキシラーゼの細胞内分布を、LC形態および神経密度を研究するためにこのプロトコルを用いて評価した。
LCで発現する別のタンパク質は、チロシンヒドロキシラーゼ、また、LCを含む脳スライス中の強い緑色蛍光シグナルを示し、この例のLC.Inの変化を含む、神経学的障害においてしばしば観察され、LCを介して切断された脳スライスをリン酸塩、カリウム、亜鉛、および銅について測定した場合、銅だけがシグナルの特異的な増加を示した。核を失わないように、約500ミクロン以上の組織前部と後方の組織をLCに切断し、特にこのプロトコルを初めて実行する場合は、必要以上のセクションを切断することをお勧めします。染色前の脳アトラス画像の慎重な研究は非常に有用である。
LCが免疫組織化学によって配置されると、隣接する脳スライスは、形態学的および代謝分析、ならびにX線蛍光顕微鏡による金属イメージング研究を含むさらなる研究に使用することができる。記載されたプロトコルを用いて生成された脳の切片は、LC内の銅および他の金属のレベルを定量化し、疾患メカニズムの理解に必要なLC外領域のレベルと比較するために使用することができる。このプロトコルのさらなる応用として、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、およびLCで個別に発現する他のタンパク質、または共染色アッセイにおいて、LC形態および神経密度の研究の豊富および細胞内分布の検出が挙げられる。
