著者らは、トウモロコシ遺伝学協力、トウモロコシ細胞ゲノミクスプロジェクト、デイブジャクソン(ニューヨーク州コールドスプリングハーバー研究所)、アンW.シルベスター(イリノイ州シカゴ大学海洋生物学研究所)、アンドレアガラボッティ(ニュージャージー州ラトガース大学)、キャロリンG.ラスムッセン(カリフォルニア大学リバーサイド校)、および変異株とトランスジェニック株を提供してくれたこと、および大学の高度な光学顕微鏡コアのロバートF.ベイカーとアレクサンダーユルケビッチに感謝しますミズーリ州-コロンビア州は、共焦点顕微鏡検査の支援をしてくれました。JMRは、J.ウィリアムフルブライトフェローシップ、ダイアンP.およびロバートE.シャープ基金、および国立科学財団の植物ゲノム研究プログラム(IOS-1546873)からPMへの支援を受けました。CDTC、EDCDP、およびRJRRは、DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarshipによってサポートされています。DODLは、トーマス・スタインバグラー神父SJ学術奨学金によってサポートされています。RJRRは、Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarshipによってサポートされています。この研究は、アテネオデマニラ大学の理工学部とリサール図書館の支援を受けました。

トウモロコシの葉の原始のイメージングのための改良された方法

著者には、開示すべき利益相反はありません。

細胞イメージング用のトウモロコシ葉原基を調製するための2つの方法を提示する。第1の方法(プロトコルセクション2)は、横断面分析のための原基の測定を可能にし、第2の方法(プロトコルセクション3)は、全マウント分析のための原基の展開および平坦化を可能にする。これらの方法は、トウモロコシの葉の原基24におけるFPの細胞イメージングを容易にし(図4および図5に示すように)、トウモロコシの葉のイメージングの課題に対する簡単な解決策を提供します。プロトコルセクション2は、ステージングパラメータ9、16のみに依存するのではなく、セクショニング前に原基を測定することにより、解剖時間を短縮し、サンプリング精度を向上させます。市販のナノテープを用いて、プロトコルセクション3は、トウモロコシの全葉原基のイメージングの長年の問題を解決する。このプロトコルは、透析チューブ31を使用した以前の方法を改善し、CTおよびMRI11、32、33よりもはるかに安価な代替手段です。ただし、葉の解剖学的特徴を視覚化し、最適な結果を生成することになると、両方のプロトコルにいくつかの制限があり、表2に概説し、以下で詳しく説明します。
プロトコルセクション2では、葉原基の厚い横断切片の細胞輪郭を視覚化することが困難であり、細胞壁または原形質膜結合蛍光色素による対比染色は満足のいく結果を提供しませんでした。例えば、FM 4-64は、原形質膜FPマーカーであるp Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39(PIP2-1-CFP;図3A-D)。この制限を克服するために、ビブラトームを使用してより薄い組織切片(~0.1 mm)58を作成し、細胞の輪郭の鮮明な明視野イメージングを可能にしたり、対比染色プロトコルを最適化したりすることをお勧めします47,59。
プロトコルセクション3の主な制限は、プロトコルステップ3.2.5〜3.2.6(図3E-K)で詳しく説明されているように、引き裂き、損傷、または気泡なしでリーフを取り付けるのが難しいことです。トウモロコシの葉は左右対称であるため、視覚化9には、葉全体のマウントではなく、ハーフリーフマウントで十分な場合があります。これを行うには、原基を中央肋骨まで広げた後、縦軸に沿ってかみそりの刃で切断し、葉の半分だけを取り付けることができます。プロトコルセクション3の別の制限は、葉の厚さがディープイメージング中の蛍光色素シグナルの光学分解能を制限し得ることである。この問題に対処するために、組織透明化技術60を採用することができる。しかし、植物組織のイメージングに一般的に使用されている透明化試薬であるClearSee61は、サンプルとカバーガラスがナノテープから剥離するため、プロトコルに適合しないことがわかりました。この問題に対する潜在的な解決策は、葉試料の上に半透膜31を適用し、ナノテープによって所定の位置に保持されたまま透明溶液で処理することを可能にすることである。展開した葉に液体溶液を適用することを可能にするこのような方法は、以前はトウモロコシの花序の発達には最適化されていたが、全葉原基には最適化されていない全マウントRNAin situハイブリダイゼーションおよび免疫局在技術にも使用できる62,63。
実生段階でも大きな葉の原基を持つトウモロコシのプロトコルについて説明しました。イネ、オオムギ、コムギ、セタリア、ブラキポディウム16,23,64,65,66など、葉の原基がはるかに小さい他の草種では、これらのプロトコルを効果的に適用するために追加の精密ツールの使用が必要になる場合があります。さらに、これらのプロトコルは、組織形成と細胞応答のリアルタイムの動的プロセスをキャプチャする生細胞イメージングを目的としていませんでした。しかし、植物の生細胞イメージングにおいて蛍光プローブ、イメージング技術、およびコンピューティング能力が進歩し続けるにつれて67、将来の研究はこれらのプロトコルに基づいて、草の葉原基のユニークな特徴に合わせたライブセルイメージング戦略を開発する可能性があります。

草作物は世界人口の食料とバイオ燃料の主要な供給源であり1、葉の解剖学的構造を改善することは生産性を向上させる可能性があります2,3。しかし、イネ科植物の葉の解剖学的構造がどのように調節されているかについての現在の理解は限られており4、葉の解剖学的および生理学的特性の多くは発生の初期に事前に決定されているため、葉の原基の分析が必要です5,6,7。蛍光や共焦点イメージングなどの細胞イメージング技術は、草の葉の解剖学や細胞形質を研究するために不可欠ですが、これらの技術は葉の渦巻きの中で深く覆われて転がっているため、草の葉原基に適用することは困難です。私たちは、草の葉の解剖学と発達を研究するためのモデルシステムであるトウモロコシの葉原基の蛍光および共焦点分析のために、横断切片と展開された全葉マウントを準備する方法を開発することによってこの問題に対処しました2,8。
トウモロコシの葉は、すべての草の葉と同様に、茎を包み込み、芽9,10,11,12,13を発達させる鞘を備えたストラップのような刃で構成されています。葉は苗条頂分裂組織(SAM)から異形パターンで発達し、新しい葉はそれぞれ前の葉の反対の位置から始まり、垂直軸に沿って2つのランクの葉が得られます(図1A)14。各葉原基の発達段階はSAMに対する相対的な位置によって識別され、最も近い原基はプラストクロン1(P1)と呼ばれ、次の原基はP2、P3などと呼ばれます(図1B、C)2。発達中(図1D)、葉の原基は最初にSAMの基部の周りに三日月形のバットレスとして現れ(P1)、次に分裂組織(P2)9,10,11に広がるフード型の原基に成長します。フードの基底縁は横方向に拡大し、先端が上向きに成長するにつれて互いに重なり合い、円錐形の原基(P3-P5)10を形成します。その後、原基の長さは急速に成長し、葉の軸方向側にフリンジ状の突起である結紮が形成されると、基部の鞘と刃の境界がより顕著になります(P6 / P7)。最後に、葉は定常状態の成長中に渦巻きから出てくるときに展開し、分裂細胞はブレードの小さな基底領域内で制限され、近位遠位軸に沿って細胞が拡大および分化する勾配を形成します(P7/P8)15。トウモロコシ苗の苗条の頂点には、発育のさまざまな段階で複数の原基が含まれているため、葉の発達を研究するための優れたモデルとなっています8。
初期の葉の発達を正確に分析するには、他の成長または形態学的パラメータに関連して原基発達の明確な段階を定義するための病期分類または標準化された基準の使用が必要です。葉の原基は草の芽の中に隠れているため、研究者は通常、植物の年齢や出現する葉のサイズなどのパラメーターを、葉の原基の段階とサイズの予測因子として使用します9,16。トウモロコシでは、植物の年代順の年齢は、植え付けまたは発芽後の日数のいずれかによって決定されます(DAP / DAG)17,18。栄養段階(V期)は、目に見える襟、結紮と耳介の位置に対応するブレードと鞘の間の軸側の淡い線、ブレードの基部にある一対のくさび形の領域(図1A、B)17,19。20〜25 DAGの間で、SAMは花序分裂組織に移行し、新しい葉の生成を停止します20。トウモロコシの葉の原基の成長速度は、環境や植物の遺伝子型によって異なります。このため、植物の年齢と出現する葉のサイズは、葉の原基のサイズを正確に予測することはできません。ただし、これらのパラメーターを使用すると、実験目的で原基のステージとサイズの範囲を予測するのに役立ちます。
横断面分析は、シュート全体の単一のセクションで複数のプラストクロンのサンプリングを可能にするため、トウモロコシおよび他の草の葉の解剖学的構造および発達を調べるための一般的な方法である21,22,23。この方法は、周囲の葉が切断および取り付け中に葉の原基を所定の位置に保つ足場として機能するため、新鮮なサンプルの細胞イメージングにも便利です24。ただし、この方法の欠点は、無傷のシュートから切断するときに、原基内のターゲットプラストクロンと領域を正確に特定することが困難な場合があることです。さらに、葉の成長はプラストクロン間および近位遠位軸2,5に沿って異なるため、不正確なサンプリングは、特定のセクションの原基の発達段階と領域の誤った解釈をもたらす可能性があります。したがって、正確な横断面サンプリングの方法を開発することは、イネ科植物の解剖学的および発生的分析の精度と再現性を確保するために重要です。
全葉マウント分析により、増殖増殖25や静脈パターニング26、27、28など、臓器全体で発生する組織および細胞プロセスの包括的かつ統合的な調査が可能になります。この方法は、葉の傍皮の概要を提供し、横断面分析を使用して検出することが他の方法では困難であろう明確なプロセスおよびパターンの発見を可能にする24、27。シロイヌナズナとは異なり、すでに全葉マウントをイメージングする方法が確立されています29,30、現在、草の展開された全葉マウントをイメージングするための標準的な方法はありません。単離されたトウモロコシの葉の原基を展開するための以前のプロトコルは、珍しい材料を含み、細胞イメージングには適していませんでした31。コンピュータ断層撮影(CT)や磁気共鳴画像法(MRI)などの高度な画像技術は、原基11,32,33を分離して展開することなく3D解剖学的情報を取得できますが、高価であり、特殊な機器が必要です。トウモロコシや他のイネ科植物の葉原基の丸く円錐形の形態によって課せられる制約を克服する技術を開発することは、それらの解剖学的および発達的形質の調査を進めるでしょう。
ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。これらの方法を用いて、トウモロコシの葉原基における静脈数を定量化し、蛍光タンパク質(FP)24による時空間的ホルモン分布をマッピングしました。最初の方法は、ワイヤーストリッパーでトウモロコシの苗から古い葉の上部を取り除くことです(図1E)。原基(P5-P7)の先端を露出させることで、周囲の古い葉を完全に取り除くことなく長さを決定することが可能になり、簡単で正確な切片作成が可能になります。2番目の方法は、透明な両面ナノテープで全葉原基(P3-P7)を展開および取り付けることです(図1F)。これらの方法は、様々なFPs24を可視化するのに適しているが、蛍光色素および透明化試薬を使用するための最適化が必要である。さらに、ImageJ/FIJI34 の Z スタックの平坦化、画像のステッチング、およびチャネルのマージに関するいくつかの手順について概説します。これらの方法は、トウモロコシの葉の日常的な蛍光または共焦点イメージングに役立ちますが、イネ、セタリア、ブラキポディウムなどの他のモデルイネ科植物にも適用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> 図1:トウモロコシ葉原基の構成と形態、および方法の概要 。 (A)トウモロコシ苗の模式図。トウモロコシには葉状突起があり、新しい葉は前の葉の反対側の位置から始まります。葉番号は、葉が発芽から出てきた年代順を示します(すなわち、最初の葉、L1、2番目の葉、L2、3番目の葉、L3など)。各葉は遠位刃と、結紮と耳介に対応する襟で描かれた基底鞘を持っています。襟が見える一番上の葉は栄養段階を示します。この例の苗はV2ステージにあり、L2カラー(矢じり)が見えます。はさみアイコンは、収集するために苗を切る必要がある中胚軸(me)の場所を示します。(B)単離されたL1〜L4を示す解剖シュートの模式図、(C)に拡大画像として示した葉原基L5〜L9。プラストクロン数は、SAMに対する原基の位置を示し、最も若い葉の原基(P1)がSAMに最も近く、古い葉の原基(P2、P3、P4など)が連続して遠くなります2。(D)P1からP5までのトウモロコシ葉原基の形態の模式図。(E)トウモロコシ葉原基の横断面解析方法の概略概要。(1)ワイヤーストリッパーで古い葉を切り取ります。(2)原基を測定し、シュートを切片化します。(3)イメージングと処理のためにスライドにセクションを取り付けます(4、5)。(F)トウモロコシ葉原基のホールマウント分析方法の概略概要。(1)周囲の葉を取り除き、原基を抽出します。(2)原基をナノテープ上で平らに切断して広げます。(3)イメージングおよび処理用のサンプルをマウントします(4、5)。略語:L =葉;bl =ブレード;sh =シース;co =襟;私=中胚軸;V =栄養;P =プラストクロン;SAM =頂端分裂組織を撃ちます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

トウモロコシ(Zea mays)や他のイネ科(イネ科)では、葉の原基が葉の渦巻きの中に深く覆われて転がっているため、初期の葉の発達を研究することは困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのためにトウモロコシの葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための方法について説明します。最初の方法は、ワイヤーストリッパーを使用して古い葉の上部を取り除き、葉の原基の先端を露出させ、より正確な横断面サンプリングのための測定を可能にします。2番目の方法は、透明な両面ナノテープを使用して、イメージング用の全葉原基を広げて取り付けます。トウモロコシの蛍光タンパク質レポーターの可視化と分析における2つの方法の有用性を示します。これらの方法は、トウモロコシの葉の原基の特徴的な形態によって提示される課題に対する解決策を提供し、トウモロコシおよび他のイネ科植物の葉の解剖学的および発生的形質を視覚化および定量化するのに役立ちます。

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

著者スポットライト:トウモロコシ葉原始の横断断面および展開された全マウントを調製するための改良された方法(蛍光および共焦点イメージングのための)  

蛍光および共焦点イメージングのためのトウモロコシ葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための改善された方法

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

トウモロコシ葉原基の横断面解析 プロトコルセクション2を使用して、静脈数を定量化し、FPを伴うトウモロコシの葉原基の横断面のホルモン応答パターンを特徴付けました(図4)24。葉の成長と葉脈形成における植物ホルモンオーキシンの役割を評価するために、オーキシン欠乏トウモロコシ変異体であるバニシングタッセル254の葉原基の静脈数を定量化しました。初期のプラストクロンでは、発達中の静脈は、トウモロコシの葉の原基21,22の中央細胞層で明確な細胞化を示します。しかしながら、従来の組織学的技術22を用いて静脈を同定および計数することは、労働集約的であり、時間がかかる可能性がある。そこで、静脈の定量化に、トウモロコシオーキシン排出タンパク質マーカーp Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41(以下、PIN1a-YFP)を利用し、発達中の静脈および前形成層鎖(PCS;図4A)。プロトコルセクション2を使用して、セクショニング前に原基を測定することにより、横断セクションサンプリングを標準化することができました(図4B、C)。我々は、vt2が通常よりも広い原基と多くの葉脈を有する傾向を発見し(図4D,E)24、これは完全に拡張された葉55のデータと一致し、vt2の欠陥が葉の発達の初期に始まったことを示している。プロトコルセクション2を使用して、葉原基におけるホルモン応答FPレポーターの発現パターンを体系的に調べることができました(図4F-Iの画像の例を参照)。標準化された横断サンプリングスキームを通じて、オーキシン、サイトカイニン(CK)、およびジベレリン酸(GA)応答の分布をさまざまなプラストクロンおよび葉原基の領域にわたってマッピングし、葉の成長と葉脈形成に影響を与えると仮定する新しい応答パターンを発見しました24。したがって、これらの代表的な結果は、トウモロコシの葉原基の横断断面分析のためのプロトコルセクション2の有用性を実証する。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> 図4:トウモロコシ葉原基の横断面解析の代表的な結果。 (A-E)オーキシン排出タンパク質マーカーPIN1a-YFPによる正常および消失タッセル2の葉原基の静脈数と原基幅の定量化。(A)発達中の静脈および前形成層鎖におけるPIN1a-YFPを発現するP5からP7の横断部の代表的な蛍光画像。横断切片をFITCフィルター(495-519 nm励起)を用いた落射蛍光顕微鏡で画像化した。静脈の数と原基の幅は、それぞれFIJI/ImageJのマルチポイントツールとフリーハンドラインツールを使用して定量化されました。(B)4枚目の葉の先端を露出させるためにワイヤーストリッパーで上部の葉の渦巻きを取り除いたトウモロコシ苗(L4)。括弧は投影された原基の長さにまたがり、破線は中間の長さを示します。(C)原基の形状をP5からP7まで変化させた模式図で、原基の発達段階によって中央長(水平破線)の静脈数と原基幅がどのように変化するかを示しています。(D,E)正常およびvt2のL4の中央長部分における原基幅(D)および静脈数(E)の測定。近似曲線は、測定値の10mm移動平均±平均の標準誤差(SEM)を表します。(F-I)PIN1a-YFP、オーキシン応答レポーター、DR5-RFP、サイトカイニン応答レポーター、TCS-トマト、ジベレリン酸応答マーカー、GAR2-YFP、およびオーキシンシグナル伝達入力レポーターDII-Venusの変異バージョンであるmDII-Venusの組み合わせを発現する葉原基の横断切片の代表的な共焦点画像。FPチャンネルは、各画像の明視野チャンネルに重ね合わされます。スケールバー = 200 μm (A);10ミリメートル(B);100 μm (F-I)この図は、RobilとMcSteen24の許可を得て変更および複製されています。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;vt2 = 消失するタッセル2;PCS = 前形成層鎖;YFP = 黄色蛍光タンパク質;FITC = フルオレセインイソチオシアネート;RFP = 赤色蛍光タンパク質;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;TCS-トマト = TCSv2::NLS-tdトマト;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
トウモロコシ葉原基のホールマウント分析 プロトコルセクション3に従って、トウモロコシ葉原基の全葉マウントにおけるFP発現を視覚化および分析しました(図5)。PIN1a-YFPで静脈パターンを可視化することで、初期のプラストクロンでは原基全体で静脈の形成が起こるが、発生後期の近位領域ではこの過程が制限されることが分かった(図5A)24。横断面解析を補完する全葉マウント解析では、静脈形成中のホルモン応答の組織および病期特異的パターンが明らかになりました24。一例は、PIN1a-YFP発現に対するCK応答レポーターTCSv2::NLS-tdトマト37(TCS-トマト)の発現パターンである(図5B)24。プロトコルセクション3に従うことにより、葉原基におけるFP発現の定性的および定量的分析の両方を実行することができました(図5D-F;未発表データ)。オーキシン応答レポーターDR5rev::mRFPer41(DR5-RFP)とGA応答性マーカーp Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39(GAR2-YFP)の発現パターンを、vt2および矮性植物3(d3)の全葉マウントで調べました(図5D)。また、細胞周期57におけるG1/S転移のマーカーであるpZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42(Cyclin-D2B-YFP)を用いて、正常葉原基とvt2葉原基の細胞増殖の相対レベルを比較した(図5E、F)。正常とvt2の間に有意差はなかったが、Cyclin-D2B-YFP発現は初期プラストクロンの既知の細胞増殖プロファイルと一致した31。プロトコルセクション3は、ロール形態のために画像化が困難なトウモロコシ葉原基のマウント全体を分析するための効果的な方法であると結論付けました。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> 図5:トウモロコシ葉原基のホールマウント分析の代表的な結果。 (A)オーキシン排出タンパク質マーカーPIN1a-YFPによってマークされた、発達中の静脈および形成層鎖を示す7つのDAGトウモロコシ苗の葉の原基の代表的な蛍光画像。P3-P6原基を基部から摘出し、巻き出し、軸方向を上にして平らにした。挿入図は、P3 と P4 のクローズアップを示しています。P5およびP6では、破線が増殖帯の遠位端を画定しており、そこでは形成層鎖の大部分がまだ発達および伸長している。(B,C)P5原基の近位辺縁領域におけるPIN1a-YFPおよびサイトカイニン応答レポーターTCS-Tomatoの発現を示す代表的な共焦点画像。(D)消失するタッセル2および矮性植物3の正常および単一および二重変異体におけるオーキシン応答レポーターDR5-RFP、およびジベレリン酸応答マーカーGAR2-YFPの発現を示すP4原基の代表的な蛍光画像。(E)細胞周期におけるG1/S遷移のレポーターであるサイクリン-D2B-YFPの発現を示すP3および/またはP4の代表的な共焦点画像。(F)ImageJ/FIJIを用いて原基の領域にわたるサイクリン-D2B-YFPシグナルの集積密度を測定することによって定量化された、正常およびvt2のP3/P4葉原基における細胞増殖の相対量。バーは、平均測定値±平均の標準誤差を表します。スケールバー = 500 μm (A、D、E);200 μm (B);100 μm (C)図4A-CはRobilとMcSteen24の許可を得て修正および複製されていますが、図4D-Fは著者からの未発表データです。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;VT2 =消えるタッセル2; d3 =矮性植物3; YFP = 黄色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;TCS-トマト = TCSv2::NLS-tdトマト;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;サイクリン-D2B-YFP = p Zm サイクリン-D2B::Zmサイクリン-D2B:YFP;ns = 有意差なし。au = 任意の単位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:トウモロコシ苗における葉発育病期分類の例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:プロトコルで使用される植物サンプルと材料。 (A,B)ワイヤーストリッパーを使用して上部の葉の渦巻きを取り除いたトウモロコシの苗7-8 DAG。(B)挿入図は、露出したP6原基でのシュートのクローズアップを示しています。(C-G)横断面分析(C,D)のために上部の渦巻きが除去されたトウモロコシ苗の苗条と、全マウント分析(E-G)のために周囲の葉が完全に除去された。(h)ポリウレタンゲル透明両面ナノテープのロール体。(I,J)P6葉原基(I)およびP8葉(J)の近位領域をロールアウトし、ナノテープでスライドガラス上にマウントした。(k)落射蛍光顕微鏡のステージに取り付けられた、展開された葉の原基を備えたスライドガラス。略語:DAG =発芽後の日数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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トウモロコシの葉の原基は深く覆われて転がされているため、研究が困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

トウモロコシのような草は、芽の中で葉の原基が成長し、研究を困難にします。私たちは、蛍光および共焦点イメージング用のトウモロコシの葉の横断面とマウント全体を調製するための改善されたプロトコルでこの問題に対処します。最初のプロトコルでは、ワイヤーストリッパーを使用して古い葉を切断し、切片化の前に原基を測定できるようにします。2番目のプロトコルは、透明な両面ナノテープを使用して、葉全体の原基を展開します。これらのプロトコルは、横断面の精度を向上させ、ロール状の円錐形の形態のために達成するのが非常に困難であったリーフプリモルディアの展開を可能にします。これらの方法は、トウモロコシや他のイネ科植物の葉の解剖学的および発生的形質を視覚化および定量化するのに役立ちます。これらの手法をもとに、イネ科植物の発育における課題を解決するためのライブセルイメージング戦略の開発を計画しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.8K ビュー.  Ateneo de Manila University. トウモロコシのような草は、芽の中で葉の原基が成長し、研究を困難にします。私たちは、蛍光および共焦点イメージング用のトウモロコシの葉の横断面とマウント全体を調製するための改善されたプロトコルでこの問題に対処します。最初のプロトコルでは、ワイヤーストリッパーを使用して古い葉を切断し、切片化の前に原基を測定できるようにします。2番目...

ビデオ: 著者スポットライト:トウモロコシ葉原始の横断断面および展開された全マウントを調製するための改良された方法(蛍光および共焦点イメージングのための)  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

生物学

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

トウモロコシ葉原基の横断面のイメージング

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.