この技術の主な利点は、マウスの心臓のいずれかの迅速なイメージングを可能にすることです。そして、遺伝子治療後の空気チャネルの存在を観察するために使用することができる。この方法は、発達の心臓病に関する洞察を提供することができますが、神経学や肺科学などの他のシステムにも適用できます。
一般的に、大人のマウス心臓のイメージングを取り付けることは困難であり、共焦点および反転顕微鏡のような他の伝統的な技術とは異なるため、個人はこの技術に苦労します。405ナノメートル、473ナノメートル、532ナノメートルの3波長の連続波レーザーを配置します。次に、ミラー1を貼り付け、梁に45度のミラー面に合わせます。
これにより、レーザーは、両面照明の設定を形成するビームスプリッターに向かって導きます。次に、50ミリメートル径の中性密度フィルタ、ビームエキスパンダー、および直径25ミリメートルのピン穴を通してビームを通過し、すべて互いに150ミリメートル配置する。50-50ビームスプリッターを通してビームを通過し、ピンホールから150ミリメートルを配置します。
次に、ビームスプリッターから150ミリメートルのミラーを90度で前方ビームに配置し、ミラー面がビームに対して45度の角度になるように位置合わせします。次に、ミラー2から100ミリメートルのミラーを配置し、ミラー面がミラー2から反射したビームに対して45度の角度になるように位置合わせします。この反射ビームを使用して、デュアル照明ライトシートの片側を形成します。
ビーム スプリッターの反対側に、ミラー平面が前方方向に放出される梁に対して 45 度になるように、ミラーを 5 つ配置します。ミラー5から放出されるビームを使用して、デュアル照明ライトシートの2番目の側を形成します。次に、全身的な方法で両面照明システムを設定します。
ミラー3から250ミリメートル離れた円筒レンズを配置し、別の同一の円筒レンズをミラー5から150ミリメートル離れたデュアル照明設定の反対側に置きます。次に、2つのミラーを、それぞれ円筒レンズに沿って、90度のビームを反射するために50ミリメートルの距離に置きます。ライトシートの両側に、1枚のレンズから一対の二重体を形成し、最初のレンズは前のミラーから100ミリメートルに配置され、直径1インチ、焦点距離100ミリメートルを有する。
2番目のレンズはレンズ1から160ミリメートル、直径1インチ、焦点距離60ミリメートルを配置する必要があります。次に、照明目標を1と2つの150ミリメートルを前のアクロマティックダダレットから配置し、ビームに合わせて配置します。目的から放出されたビームは、サンプルを撮像するためのライトシートを形成する。
まず、0.53マイクロメートルビーズ溶液を1~150,000の予温屈折率マッチング溶液で希釈し、1%低融解性アガロースを用いて蛍光ビーズサンプルを調製します。次に、内径12ミリメートルのホウケイ酸ガラスチューブを、外径18ミリメートルの30ミリメートルに使用します。ホウケイ酸チューブ中のビーズアガロース溶液をピペットし、アガロースを室温で固化させます。
さて、3DプリントABSチャンバーに99.5%のギルセロール溶液を充填します。ビーズを含むホウケイ酸ガラスチューブをチャンバーの中に置きます。3D電動トランスレーショナルステージをホウケイ酸ガラスチューブに取り付けて、ABSチャンバ内のサンプルの動きと向きを制御します。
次に、カスタム設計のソフトウェアを使用して、毎秒30フレームのレートでsCMOSカメラを使用して画像を取得します。モーターコントローラを使用して、サンプルを横方向に1ミリメートル移動し、サンプル全体が画像化されるまで、1ミリメートルずつ画像を取得します。可視化ソフトウェアを使用して取得した画像を積み重ね、これらのビーズ画像を使用してシステムのポイントスプレッド機能を測定します。
pH 7.5 の屈折率マッチングソリューションを使用し、1%のアガロースをマッチング溶液に溶解します。クリアした成人マウスの心臓サンプルを屈折率マッチング溶液に入れ、1%のアガロースを溶解します。次いで、試料をホウケイ酸ガラスチューブに挿入し、アガロースを室温で固化させます。
3D プリント ABS チャンバ内でサンプルの動きと向きを制御するために、3D 電動トランスレーショナル ステージをホウケイ酸ガラスチューブに取り付けます。サンプルをガウスビームの中心に配置し、デュアル照明システムで作成します。次に、sCMOSカメラの取得速度を毎秒30フレームに設定します。
モーターコントローラを使用して、サンプルを軸方向に1ミリメートル移動し、1ミリメートルずつ画像を取得します。サンプル全体がイメージ化されるまで続けます。視覚化ソフトウェアを使用して、取得した画像をスタックします。
これらのイメージ スタックを使用して 3-D イメージを開発します。これを実現するために、先に決定した点広がり関数をデコンボルブし、取得した画像スタックに利用します。最後に、ピクセルしきい値の強度値を設定して、心臓の輪郭を観察し、このグレースケールの強度に基づいて画像に疑似色を追加します。
出生後1日目には、弁、心房、心室、孔雀の筋肉、および線維柱を視覚化することができます。7日目の出生後には、特徴はさらに定義されています。心房、心室、心室腔の寸法、心室の壁の厚さはすべて明らかです。
心臓内の心筋細胞分化を研究するために、異種性ノックインマウスを心筋細胞を示すためにクレラベルを付けた。ラベル付けされたセルは、各平面方向にここに示されています。3 つの平面がマージされ、心臓の 3D レンダリングが作成されました。
インセット内の赤い丸の領域は、透明度の技術を受け、ホウケイ酸ガラスチューブに挿入された後、2つの半透明のマウスの心臓を示しています。出生後マウスの研究に加えて、イメージングシステムは、成体マウスの心臓を研究するためにも使用することができる。ここでは、GFP のタグ付き ROMK チャンネルは 7.5 か月で表示されます。
これらは主に心室壁に見られた。一度習得すると、このテクニックは1〜2分で行うことができます。この手順を試みるとき、チューブ内のサンプルの周りのすべての気泡を除去することが重要です。
画像スタックの自動セグメンテーションなどの他の方法は、心血管損傷および再生に関連する追加の質問に答えるために実行することができる。その開発後、この技術は、マウスの出生後および成人発達段階における心臓アーキテクチャを研究するために研究者によって使用された。
