当社のプロトコルは、生体内のゼブラフィッシュ心臓を研究するための最適化されたツールを提示し、心臓イメージングのためのデータ取得および分析パイプラインと共に固定化技術を埋め込むことについて説明します。ゼブラフィッシュは、薬物スクリーンのようなアプリケーションのための大きな可能性を持つ心臓モデルシステムです。心臓病を研究する際には、生理学的条件下で穏やかな画像を可能にするプロトコルが重要です。
ここで紹介するワークフローはゼブラフィッシュ胚性心臓イメージングに焦点を当てていますが、イカ、ワーム、ヒドラを含む様々なサンプルや実験に変更バージョンを適用できます。まず、所望のトランスジェニックラインの繁殖から得られた胚を採取することから始める。E3魚媒体で満たされたペトリ皿で胚を摂氏28度に保ちます。
マイクロマニピュレーターに取り付けられたボアガラス針を使用し、ピコインジェクターに接続して、魚を固定化するために1つまたは2つの細胞段階胚の黄身に30ピコグラムのα-ブンガロトキシンmRNAを注入する。E3培地で満たされたペトリ皿に卵を摂氏28度に保ち、イメージングまで新鮮なE3培地を含む新しい皿に24時間ごとに卵を移します。色素形成を防ぐために、ゼブラフィッシュの背景がアルビノでない場合、受精後25時間で魚を0.2ミリモルチロシナーゼ阻害剤1-フェニル2-チオ尿素を含むE3培地を含む新しい皿に移す。
フッ素化エチレンプロピレンチューブをまっすぐにするには、ポリマーチューブとオートクレーブを180°Cで2時間調整するために、正しい内径のガラスまたはスチールオートクレーブの安全なチューブにチューブを置きます。チューブが室温に達したら、まっすぐにしたポリマーチューブを取り外します。チューブを洗浄するには、50ミリメートルの注射器を使用して、水酸化ナトリウムの1モルでチューブを2回洗い流します。
チューブを50ミリリットルの遠心分離チューブの大きさに切り、0.5モルの水酸化ナトリウムと超音波で満たされた遠心管に10分間入れます。フッ素化エチレンプロピレンチューブを二重蒸留水で洗い流し、続いて70%エタノールを洗い流します。移管は、新鮮な遠心管に含まれていた70%エタノールと10分間の超音波。
超音波処理後、二重蒸留水で最後の時間のためにチューブを洗い流し、二重蒸留水を含む遠心管に保管してください。低融点アガロースをE3培地に溶解した後、溶融アガロースをガラスまたはプラスチックペトリ皿に注ぎ、1〜2ミリメートルのコートを作ります。アガロースが固まったら、乾燥を防ぐために寒天の上にE3培地を静かに注ぎます。
パラフィンフィルムでプレートを密封し、摂氏4度で保管します。トリケーヌのストック溶液を解凍し、組み込み培地として使用するメチルブルーなしでE3培地に0.02%トリカインを加えます。使い捨てのガラスピペットを使用して、埋め込み培地に魚を移します。
魚が動かなくなり、心臓がコントロールと比較して同様の速度で鼓動していることを確認します。フッ素化エチレンプロピレンチューブをカミソリの刃で理想的な長さに切ります。鈍いエンドカニューレで注射器を準備します。
注射器に空気を入れ、チューブを針に取り付け、残りの水をシリンジを空にして静かに洗い流します。次に、注射器に取り付けられたフッ素エチレンプロピレンチューブを媒体で充填します。チューブに胚を挿入し、魚の頭部をチューブの端部に近づけ、泡形成を避ける。
カミソリの刃を使用して、慎重に鈍いエンドカニューレ、または針の端にチューブをカットします。寒天コーティングされた皿の上に任意の液体を捨てた後、寒天にまっすぐチューブを突き出します。チューブを回転させ、それを取り出してアガロースのベッドからプラグを外します。
チューブの端に寒天プラグが存在する確認を行います。長期間イメージングの場合は、各基軸方向の管に3〜5個の穴を切断し、チューブの軸に垂直にカミソリの刃を配置して魚の端部の少なくとも5ミリメートル上に切り、取り付け媒体に到達するまで30度でチューブに切開を行う。次に、180度で2回目の切開を行い、穴を作り、チューブを転がしてカットを明確に視覚化します。
取り付けられた胚を、画像の準備ができるまで、埋め込み培地を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。サンプルホルダーにチューブを取り付け、埋め込みメディアでイメージングチャンバーを充填します。サンプルホルダーをステージに置き、サンプルをチャンバーに浸します。
目視で心拍数を評価し、心拍数が遅すぎる場合は、埋め込み魚の健康状態を確認し、サンプルを捨てます。再現可能なイメージングのために常に同じサンプル位置を使用し、両方の目が焦点面にあるように魚を回転させます。その後、魚を約20〜30度反時計回りに回し、受精後48時間回転させます。
魚がレーザーパワーに適応したら、最高の画質を与える照明側を選択します。各 Z 平面で、毎秒 300 フレーム以上で 4 ~ 5 回のハートビートを記録します。鼓動心臓を記録するには、サンプルをライトシートを通して段階的に移動し、心臓の深さ全体をカバーするために1〜2マイクロメートルのZ間隔を使用します。
データを探索し、レンダリングゼブラフィッシュの心臓のムービーを生成する3Dレンダリングソフトウェアに4Dファイルをロードします。受精後48時間で心臓はループを受けたばかりで、心室と心房の2つのチャンバーを持っていますが、まだバルブを開発していません。心室、房室管、アトリウム、流入路、流出路などの異なる心臓構造は容易に区別可能である。
データは正確な鼓動を示し、心臓の2つの細胞層、心筋、収縮および生成力の単一細胞筋層、および血管系に心臓を接続する単一細胞層である心内膜との間の複雑な相互作用を明らかにした。最も重要なことは、ステレオスコープ下でサンプルの健康状態と一貫したハートビートを常に確認することです。従来の技術はしばしば心臓の形や機能に影響を与えますが、私たちの方法は、初期の胚性心臓の基礎を理解するのに役立つ鼓動心臓の動的な妨げのないデータを提供します。
