このプロジェクトに献血してくださったボランティアの皆様に感謝いたします。また、Ellen Schur博士と彼女のチームには、彼らの研究から追加のサンプルを提供してくださったことに心から感謝します。また、原稿をレビューし、読みやすさのために編集してくれたAndrew Kirsh氏にも感謝します。この作業は、P01AG001751、R01AG078279、P30AR074990、P30DK035816、P30DK017047、R01DK089036、K01HL154761、T32AG066574の資金源によって支援されました。

ここで提示するデータおよび方法開発のための血液サンプルの収集は、ワシントン大学の内部審査委員会によって承認されました。代表的な結果には、Jackson Laboratoriesから購入した雄のC57BL/6Jマウス(生後5〜7ヶ月)のデータも含まれています。すべての動物用処置は、ワシントン大学動物福祉局によって承認されました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。このプロトコールの試薬調製は、 補足ファイル1に記載されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概要。 高分解能蛍光肺活量測定を用いたワークフローにより、新鮮ヒト血液サンプルから単離された単球(CD14+)およびT細胞(CD3+)のミトコンドリア膜電位の変化を評価します。略語:TMRM、テトラメチルローダミンメチルエステル;SUIT、基板-アンカプラー-阻害剤滴定;ADP、アデノシン二リン酸;ディグ、ジギトニン;マル、リンゴ;ピル、ピルビン酸;グルート、グルタミン酸;D1-10、10回連続ADP滴定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1.全血からのバフィーコートの分離
注:細胞単離はKramer et al.27から改変されています。
<ol><li>RPMI、密度勾配、および遠心分離機が室温に達するまで待ちます。開始する前に、バイオセーフティキャビネットと材料を滅菌してください。</li>
	<li>静脈血を3本の10mL K2EDTAチューブに集めます。チューブを少なくとも3回反転させます。</li>
	<li>チューブを500 x g 10分間(22°C、9加速[acc]、2減速[dec])で遠心分離します。</li>
	<li>各チューブから1 mLの血漿を取り出し、将来の分析のために-80°Cで保存します。</li>
	<li>血漿と赤血球層の半分を各チューブから単一の50 mL円錐管に移します。.RPMIを40mLマークまで追加します。少なくとも3回反転します。</li>
	<li>10 mLの血漿溶液を、3 mLの密度勾配を含む4本の15 mL円錐管にゆっくりと層状にします。.</li>
	<li>700 x g で30分間遠心分離します(22°C、5 acc、2 dec)。</li>
	<li>赤血球を乱すことなく、すべての血漿と末梢単核細胞(PBMC)を含むバフィーコートを収集します。</li>
	<li>500 x g で10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離し、上清を吸引します。</li>
	<li>PBMCペレットを10 mLのRPMIに再懸濁し、500 x g で10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離して、PBMCペレットを1x-2x洗浄します。</li>
</ol>2. CD14+細胞とCD3+細胞の磁気分離
<ol><li>磁性セルセパレーターの磁場にカラムを置きます( 材料の表を参照)。RP-5 3 mLでカラムを洗浄します。</li>
	<li>PBMCペレットを80 μLのRP-5および20 μLの抗CD14マイクロビーズに再懸濁します( 材料の表を参照)。4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を1 mLのRP-5で再懸濁し、懸濁液をカラムにロードします。「Flow-through 1」とラベル付けされた15 mLの円錐形チューブに流れる非標識細胞を回収します。すべての細胞懸濁液がカラムを通過するまで待ってから、3 mLのRP-5 3xで洗浄を続け、すべてのフロースルーを収集します。</li>
	<li>カラムを磁場から慎重に取り外し、新しい 15 mL コニカルチューブに置きます。RP-5 mL を 5 mL 加え、すぐにプランジャーを使用してカラム内容物を「CD14+」とラベル付けされたコレクションチューブにパージします。</li>
	<li>「Flow-through 1」を500 x gで10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離し、上清を吸引します。</li>
	<li>フロースルー1の細胞を使用して、抗CD3マイクロビーズ(材料表を参照)を使用して手順2.2〜2.5を繰り返し、T細胞を単離します。</li>
	<li>T細胞(CD3+)および単球(CD14+)を含むチューブを300 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットをRP-5 1 mLに再懸濁します。</li>
	<li>血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞濃度を測定します。 注:細胞のカウントは、1:10または1:20の細胞希釈液10μLを血球計算盤に加えることによって行うことができます。1つは、血球計算盤36を用いて細胞を数えるために以前に発表されたプロトコルを参照してもよい。</li>
	<li>250万個の単球または500万個のT細胞を新しい遠心チューブにピペットで挿入します。2000 x gで30秒間遠心分離し、上清を吸引し、細胞をMiR05に再懸濁して、総容量20 μL、最終濃度1億2,500万単球または2億5,000万T細胞/mLにします。 注:最終濃度は、20μLの容量で250万個の単球または500万個のT細胞を注入するために選択されました。脾臓から単離されたマウスT細胞もこの方法を使用してテストされています。手順は 、補足ファイル 1 にあります。</li>
</ol>3. 高分解能蛍光肺活量測定 - 酸素およびTMRM蛍光キャリブレーション
注:この方法は、Pharaohらによって透過性繊維で行われた以前の研究から適応されました.11。クエンチモードには、抑制性のない高濃度のTMRMが使用され、マトリックス中のmMP濃度とTMRM濃度の関係が逆転します。したがって、mMPの減少は、マトリックスからのTMRM色素の放出および蛍光32の増加をもたらす。
<ol><li>製造元の指示に従って、O2K呼吸計に0.5mLチャンバーを取り付けます( 材料の表を参照)。機器の電源を入れ、データ収集のためにメーカーが提供するソフトウェアに接続します。</li>
	<li>温度を37°Cに調整し、攪拌速度を750rpmに調整します。</li>
	<li>チャンバーを蒸留水で3回洗浄します。水を 0.54 mL の Mir05 と交換し、ストッパーを完全に閉じて、統合吸引システム (ISS) で余分なバッファーを取り除きます。ストッパースペーサーを使用して、室内の酸素がチャンバーの酸素と平衡するようにストッパーを上げます。</li>
	<li>酸素フラックスが安定したら、製造元の指示に従って空気酸素校正(R1)を実行します。 注意: 酸素フラックスが安定するまでに>30分かかる場合があります。酸素センサーは、ジチオナイト滴定を使用した別々の実験から、50〜200μMのゼロ点酸素フラックス(R0)とバックグラウンド酸素フラックスを測定する必要があります。具体的な方法については、メーカーのマニュアルに記載されています。</li>
	<li>ストッパーを閉じてチャンバーを密閉します。 注:透過処理繊維を使用した実験とは異なり、チャンバーはPBMCの高酸素化を必要としません。酸素レベルは50〜250μMに維持する必要があります。酸素濃度が閾値を下回った場合、チャンバーの酸素が室内の空気中の酸素と平衡化できるように、チャンバーを部分的に開くことができます。</li>
	<li>TMRMキャリブレーション<ol><li>AmRフィルターセット付きの緑色LED蛍光センサー(例:525 nm)を使用します(材料の表を参照)。蛍光光度計のゲインを1000に、強度を1000に設定します。フルオセンサーの電源を入れ、ベースラインの記録を開始します。</li>
		<li>2.5 μL の 0.05 mM TMRM を注入し、次の 2.5 μL 注入前にシグナルが安定するのを待ちます (~2 分)、チャンバ内の合計 TMRM 濃度が 1 μM TMRM になるように合計 4 回の注入が行われます。すべての注射にはハミルトンシリンジを使用してください。.</li>
		<li>5点キャリブレーションでは、0、0.25、0.5、0.75、および1.0 μMのTMRMを表す各注入の蛍光シグナル(電圧)を選択して、フルセンサーをキャリブレーションします。</li>
	</ol></li>
</ol>4. Substrate-Uncoupler-Inhibitor滴定(SUIT)プロトコール
注:TMRMシグナルは注入のみに応答して変化するため、20μLの細胞懸濁液の代わりに20μLのMir05をチャンバーに注入するブランク実験を実行します(代表的な結果で説明されています)。ブランク実験とサンプル実験の両方で、次の注入前に酸素フラックス信号が安定する(約2〜3分)のことを待ちます。以下の滴定プロトコルと予想される観察結果を 表1に示します。
<ol><li>酸素フラックスが安定したら、酸素フラックスとTMRMシグナルの両方を「プレセル」として選択し、ラベル付けします。</li>
	<li>500万個のT細胞または250万個の単球を含む細胞懸濁液を~20μLに注入し、約10分間測定します。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、"Cell"とラベル付けします。</li>
	<li>1 mg/mL ジギトニン 2 μL を注入して細胞を透過化します (最終濃度: 4 μg/mL)。20分待ちます。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、"Dig"とラベル付けします。 注:ジギトニン濃度は、別々の実験で最適化することをお勧めします。</li>
	<li>2.5 μLの1 Mコハク酸(最終濃度:5 mM)を加えます。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択して「SUCC」とラベル付けします。</li>
	<li>酸素フラックスが安定したら、100 mMリンゴ酸(最終濃度:1.0 mM)を5 μL、1 Mグルタミン酸(最終濃度:10 mM)を5 μL、500 mMピルビン酸(最終濃度:5 mM)を5 μL添加します。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、"MPG"とラベル付けします。</li>
	<li>酸素フラックスが安定したら、ADPを滴定します。各滴定のレートを選択し、滴定の数に応じて1から10まで順番に「D」とラベル付けします。 表2の滴定スキームを使用します。</li>
	<li>酸素フラックスが安定したら、蛍光シグナルが最大に達するまで、0.25 mMシアン化カルボニルp-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)の一連の1 μL滴定を実行します。酸素フラックスと最小膜電位を表すTMRM信号の両方を選択してラベル付けし、「FCCP」とラベル付けします。 注:ミトコンドリア膜電位を枯渇させるには、通常、0.5〜1.0μMのFCCP濃度が必要です。 注意: FCCP は有毒です。適切な取り扱いについては、安全データシート(SDS)を参照してください。</li>
	<li>オプション:酸素フラックスが安定したら、0.25mMロテノンを1μL注入して複合体Iを阻害し、複合体IIを介して呼吸能力を決定します。 注:膜電位の変化は、アンカプラーで滴定した後は意味がなくなります。 注意: ロテノンは有毒です。適切な取り扱いについては、SDSを参照してください。</li>
	<li>酸素フラックスが安定したら、1.25 mM(最終濃度:2.5 μM)のアンチマイシンAを1 μL注入して、ミトコンドリア呼吸を抑制します。 注意:アンチマイシンAは有毒です。適切な取り扱いについては、SDSを参照してください。</li>
</ol>5. ミトコンドリア膜電位の計算と解析
<ol><li>ブランク実験を使用して、ブランクサンプル(「プレサンプル」)の注入前および各注入について、較正されたTMRM値(マイクロモルTMRM)を記録します。 図 2 を参照してください。</li>
	<li>ブランク実験ごとに、「サンプル前」のTMRM濃度を1.0に設定してバックグラウンド比を計算します。その後の TMRM の比例減少を計算します。すべてのブランク実験から平均バックグラウンド比を計算します。 注:含めるブランク実験の数は、装置の精度によって異なる場合があります。 表3 の計算例を5つの異なるブランク実験から示し、平均バックグラウンド比の標準偏差が各滴定で0〜0.016に低下しました。</li>
	<li>バックグラウンド計算: サンプル実験の「プレサンプル」TMRM に各注入の平均バックグラウンド比を掛けて、各サンプル実験のバックグラウンドを計算します。 表 3 の計算例を参照してください。</li>
	<li>バックグラウンド補正:サンプルの測定されたTMRM値に実験のバックグラウンドを差し引きます。 表 4 の計算例を参照してください。</li>
	<li>FCCP 補正:各注入から FCCP バックグラウンド補正された mMP を差し引きます。 表 4 の計算例を参照してください。</li>
	<li>ADP感度曲線:ADP滴定中に収集されたmMP値を使用して、メンブレン電位の最高値と最低値をそれぞれ100%と0%に設定することにより、ADPによるmMPの減少を正規化します。優先統計ソフトウェアを使用してデータを非線形フィット回帰モデルに当てはめ、mMP 上の ADP の半値阻害濃度 (IC50) を計算します。 注:曲線は、[阻害剤]対正規化応答-プリズムの可変傾きに適合します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig02.jpg"> 図2:TMRM蛍光からのミトコンドリア膜電位(mMP)とADP感度の計算。 T細胞の1つのサンプル(n = 1)の高分解能蛍光肺量測定によるTMRM蛍光の測定からミトコンドリア膜電位(mMP)とADP感度を計算する手順。ステップ1:TMRM蛍光は、生物学的サンプルで行われたようにブランクサンプルで測定されます。ステップ2:各ブランク実験のサンプル前の信号に対する各滴定によるTMRM信号の比率を決定します。すべてのブランク実験の各滴定の平均を計算します。ステップ3:「プレサンプル」蛍光に各滴定の平均バックグラウンド比を掛けて、各サンプル実験のバックグラウンドを計算します。ステップ4:滴定ごとにバックグラウンドTMRM蛍光とサンプルTMRM蛍光の差を計算して、データをmMPまたはミトコンドリアTMRM取り込みとして表します。ステップ 5: FCCP との完全なアンカップリングが 0 mMP を反映するように mMP を修正します。ステップ6:非線形回帰を実行して、ADP濃度の増加に伴うmMPの変化をグラフ化します。測定は、健康なボランティアからの500万個のT細胞を含む0.5mLチャンバーで行われました。平均データは SEM ±平均として表され、1 回のレプリケートの 1 つのデータ ポイントはエラー バーなしで表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ヒトPBMCにおけるミトコンドリア機能の高分解能解析

著者は、利益相反を宣言しません。

このプロトコルは、高分解能蛍光肺活量測定を使用して、PBMC、単球、およびT細胞のADPレベルの増加に応答するmMPの散逸を測定することにより、エネルギー需要に対するミトコンドリア応答の感度を測定します。これは、ミトコンドリア膜電位を最大化するために複雑なIおよびII基質を添加し、ADPを滴定してATP合成酵素を徐々に刺激し、ATP生成にプロトン勾配を使用することによって行われます。
このプロトコールの重要なステップには、蛍光色素のゲインと強度を1000に設定することや、TMRM滴定中にTMRM蛍光シグナルが取得されることの確認などがあります。TMRM蛍光は滴定のたびに低下するため(この方法の制限)、ブランクサンプルを使用してバックグラウンド実験を行うことが不可欠です。また、DMSOはミトコンドリア呼吸と膜電位に対して阻害効果があることもわかったため、TMRMの作業溶液をMir05で希釈することをお勧めします(補足図1)。 
このプロトコールを試す際に使用できるいくつかの変更は、細胞濃度の調整と標準の2mLチャンバーの使用です。ただし、0.5 mLチャンバーは、膜電位と酸素フラックスの最適な応答に必要な細胞の濃度が高いため、T細胞および単球に適しています。マクロファージのように呼吸能力の高い細胞を試験する場合、細胞の濃度が低い場合に最適かもしれません。
ここで紹介する方法のさらなる制限には、少なくとも500万個のT細胞および250万個の単球が必要であることが含まれる。健康な参加者から~20mLの血液から十分な細胞を得られることが多いが、その数は健康状態、年齢、性別によって異なる可能性がある26。さらに、ミトコンドリアの容量を評価するほとんどの方法と同様に、細胞を新たに単離する必要があります。しかし、この方法は将来、凍結保存された細胞で試すことができるかもしれません。ヒトの血液からの収量と比較して、健康なマウスの脾臓からのT細胞の収量は、このアッセイを実施するのに十分です。
循環T細胞、特に長寿命記憶(Tm)細胞および制御細胞(Treg)は、エネルギーの酸化的リン酸化に依存している37。彼らのエネルギー需要と酸素消費量は低いが(例えば、安静時筋のそれと比較して)、彼らの生存は再感染と癌に対する効果的な免疫応答に不可欠である38,39,40。T細胞の酸化的リン酸化の減少は、増殖能力の障害をもたらし、T細胞の枯渇と老化を促進する5,41。さらに、ミトコンドリアの過分極は、活性化中にエフェクターCD4 T細胞によるサイトカイン(IL-4およびIL-21)の持続的な産生を促進する42。感染すると、免疫細胞の活性化と増殖のためのエネルギー必要量は、基礎代謝率の25%〜30%にもなり得る43。したがって、免疫細胞は広範囲かつ極端なエネルギー需要で機能し、このプロトコルはその範囲内のミトコンドリア応答をテストできます。
慢性炎症は、肥満、糖尿病、老化の一般的な特徴です。循環ホルモン、脂質、グルコースの調節不全は全身に影響を及ぼし、したがってミトコンドリアがエネルギー的な課題にどのように反応するかに影響を与える可能性があります。ここでは、循環PBMCにおけるミトコンドリアADP感度を評価する方法を提示しました。代謝性疾患においてADP感受性がどのように調節され、それが健康状態にどのように影響するかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

細胞が生理学的ストレスの期間に機能し、生存する能力は、恒常性を回復するためのエネルギー要件を満たす能力に大きく依存しています1,2。エネルギー需要は、さまざまな刺激に反応して増加します。例えば、運動中の筋肉の収縮が増加すると、骨格筋によるATPとグルコースの利用が増加し、感染後のタンパク質合成の増加は、免疫細胞によるサイトカインの産生と増殖のためのATPの利用を増加させる3,4,5,6。エネルギー需要の急増は、ATP/ADP比を回復するための一連の生体エネルギープロセスを引き起こします。ATPが消費されると、ADPレベルは上昇し、F1F0 ATP合成酵素(複合体V)を刺激します。これには、ミトコンドリア7内での機械的回転とADPのATPへの触媒変換を促進するためのプロトン駆動力が必要です。プロトン起電力は、ミトコンドリア内膜内の電子輸送システム(ETS)を介して基板から酸素に電子が移動する際にプロトンがポンピングされることによって生じる電気化学的勾配です。その結果、プロトン濃度(デルタpH)と電位(膜電位)の違いにより、エネルギー需要に応じてATP合成と酸素消費を促進するプロトン駆動力が生まれ、ATP/ADP比が低下したり、ADPレベルが上昇したりします。ミトコンドリアとADPとの親和性は、単離されたミトコンドリアまたは透過処理細胞のADP刺激呼吸のKmまたはEC50の計算によって決定することができる8,9。この方法は、高齢のヒトからの透過処理された筋線維が、若い被験者のそれらよりも最大酸化的リン酸化能力の50%を刺激するために、より高い濃度のADPを必要とすることを示している9。同様に、マウス骨格筋の老化は、ミトコンドリア活性酸素種(ROS)の産生を低下させるためにより多くのADPを必要とする10,11。さらに、ADP感度は、食事誘発性肥満のマウスの透過性筋線維では対照と比較して低下し、インスリンの存在下および硝酸塩摂取後に強化されます12,13。このように、ミトコンドリアがエネルギー需要に応答する能力は、生理学的条件によって異なるが、これは免疫細胞の文脈でこれまで研究されてこなかった。
末梢血単核細胞(PBMC)は、ヒト被験者14、15、16、17、18、19、20の細胞生体エネルギーを研究するために一般的に使用されます。これは主に、臨床研究で凝固していない血液サンプルから細胞が容易に入手できること、代謝摂動に対する細胞の応答性、およびミトコンドリア呼吸の最大および最小容量を決定するために阻害剤とアンカプラーを使用してミトコンドリア代謝を調査するためにさまざまなグループによって開発された方法によるものです21,22.これらの方法は、老化、代謝性疾患、および免疫機能における生体エネルギー学の役割の理解につながっています14,20,23,24。ミトコンドリアの呼吸能力は、心不全の条件下で骨格筋とPBMCでしばしば減少します18,25。PBMC生体エネルギー学は、健康な成人の心血管代謝危険因子とも相関しており17、ニコチンアミドリボシドなどの治療に反応します18。PBMCには、好中球、リンパ球(B細胞およびT細胞)、単球、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が含まれ、これらはすべてPBMCのミトコンドリア容量に寄与します26,27,28。さらに、細胞の生体エネルギー学は、免疫細胞の活性化、増殖、および再生に重要な役割を果たします23。しかしながら、これらの方法の限界は、細胞が生理学的範囲の基質の下で機能していないことである。したがって、細胞がin vivoで経験することにより関連性のある基質濃度のミトコンドリア機能を調べるには、追加の方法が必要です。
ミトコンドリア膜電位(mMP)は、原子力の主要な構成要素であり、呼吸フラックスの調節、活性酸素種の産生、タンパク質とイオンの輸入、オートファジー、アポトーシスなど、ATP産生以外のさまざまなミトコンドリアプロセスに不可欠です。mMPは、JC-1、Rhod123、DiOC6、テトラメチルローダミン(TMRE)またはメチルエステル(TMRM)、サフラニンなどの膜分極の変化に敏感な電気化学プローブまたは蛍光色素で評価できます。後者の2つは、組織ホモジネート、単離されたミトコンドリア、および透過化組織11,29,30,31,32,33の高分解能蛍光肺量測定で成功裏に使用されている親油性カチオン性色素です。この手法では、TMRMをクエンチモードで使用し、分極するとミトコンドリアマトリックスに蓄積する高濃度のTMRMに細胞を曝露し(高mMPおよび高陽子吸引力)、細胞質のTMRM蛍光を消光します。ミトコンドリアがADPまたはアンカプラーに応答して脱分極すると、色素はマトリックスから放出され、TMRM蛍光シグナル34,35が増加する。この方法は、ヒト由来のPBMC、循環単球、およびT細胞におけるADP滴定に応答したミトコンドリア呼吸とmMPの変化を同時に測定することを目的としており、マウス脾臓T細胞にも適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine Diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td>Isolation of T-cells from mouse spleen protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-101</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>Version 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set AmR</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>44321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque 1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA blood collection tubes</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>366643</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>153516</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Malic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride&#160;(MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-MACS stand and MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Fluo Smart-Module</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>12100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-FluoRespirometer series J</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>10201-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-sV-Module (0.5 chamber)</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>11200-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04876</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130095130</td>
			<td>Isolation of T-cells from mouse spleen protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide&#160;(KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5428</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluorespirometry to assess dynamic changes in mitochondrial membrane potential in human immune cells

末梢単核細胞(PBMC)は、健康や病気に応答してミトコンドリアの呼吸能力に強い変化を示します。これらの変化は、骨格筋などの他の組織で起こることを必ずしも反映しているわけではありませんが、これらの細胞は、ヒト被験者からの生存可能なミトコンドリアのアクセス可能で貴重な供給源です。PBMCは、生体エネルギー状態に影響を与える全身信号にさらされます。このように、この集団におけるミトコンドリア代謝を調べるためのツールを拡大することで、疾患の進行に関連するメカニズムが解明されます。ミトコンドリアの機能アッセイは、多くの場合、基質、阻害剤、およびアンカプラーの最大濃度に続く呼吸出力を使用して、呼吸能力の全範囲を決定することに限定されますが、 これはin vivoでは達成できない場合があります。ATPシンターゼによるアデノシン二リン酸(ADP)からアデノシン三リン酸(ATP)への変換は、ミトコンドリア膜電位(mMP)の減少と酸素消費量の増加をもたらします。ミトコンドリアダイナミクスのより統合された分析を提供するために、この記事では、高分解能蛍光スパイロメトリーを使用して、生理学的に関連するADP濃度に対する酸素消費量とミトコンドリア膜電位(mMP)の同時応答を測定する方法について説明します。この手法では、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)を使用して、複雑なIおよびII基質による最大過分極後のADP滴定に応答するmMP分極を測定します。この手法は、老化や代謝性疾患などの健康状態の変化が、ヒト被験者のPBMC、T細胞、および単球のエネルギー需要に対するミトコンドリア応答の感度にどのように影響するかを定量化するために使用できます。

A cell&#39;s ability to function and survive in a period of physiological stress is largely dependent on its ability to meet the energetic requirement to restore homeostasis1,2. Energy demand rises in response to a variety of stimuli. For instance, increased muscle contraction during exercise increases the utilization of ATP and glucose by skeletal muscle, and a rise in protein synthesis following infection increases the utilization of ATP by immune cells for cytokine production and proliferation3,4,5,6. A spike in energy demand triggers a series of bioenergetic processes to restore the ATP/ADP ratio. As ATP is consumed, ADP levels rise and stimulate F1F0&#160;ATP-synthase (complex V), which requires a protonmotive force to drive its mechanical rotation and catalytic conversion of ADP to ATP within the mitochondrion7. The protonmotive force is an electrochemical gradient created by the pumping of protons during the transfer of electrons from substrates to oxygen through the electron transport system (ETS) within the inner mitochondrial membrane. The resulting difference in proton concentration (delta pH) and electrical potential (membrane potential) creates the protonmotive force that drives ATP synthesis and oxygen consumption in response to energy demand reducing the ATP/ADP ratio or raising ADP levels. The affinity of mitochondria to ADP can be determined by the calculation of the Km or EC50 of ADP-stimulated respiration of isolated mitochondria or permeabilized cells8,9. This method has shown that permeabilized muscle fibers from older humans require a greater concentration of ADP to stimulate 50% of their maximal oxidative phosphorylation capacity than those of younger subjects9. Similarly, aging mouse skeletal muscle requires more ADP to lower the production of mitochondrial reactive oxygen species (ROS)10,11. Additionally, ADP sensitivity is reduced in permeabilized muscle fibers of mice with diet-induced obesity relative to controls and is enhanced in the presence of insulin and following nitrate consumption12,13. Thus, the capacity of mitochondria to respond to energy demand varies under different physiological conditions, but this has not been previously explored in the context of immune cells.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are commonly used to investigate cellular bioenergetics in human subjects14,15,16,17,18,19,20. This is largely due to cells being easily obtainable from uncoagulated blood samples in clinical studies, the responsiveness of cells to metabolic perturbations, and the methods developed by various groups to interrogate mitochondrial metabolism by using inhibitors and uncouplers to determine the maximal and minimal capacity of mitochondrial respiration21,22. These methods have led to an appreciation of the roles of bioenergetics in aging, metabolic disease, and immune function14,20,23,24. Mitochondrial respiratory capacity is often reduced in skeletal muscle and PBMCs under conditions of heart failure18,25. PBMC bioenergetics are also correlated with cardiometabolic risk factors in healthy adults17 and are responsive to treatments such as nicotinamide riboside18. PBMCs include neutrophils, lymphocytes (B-cells and T-cells), monocytes, natural killer cells, and dendritic cells, which all contribute to PBMC mitochondrial capacity26,27,28. In addition, cellular bioenergetics play a crucial role in immune cell activation, proliferation, and renewal23. However, a limitation of these methods is that the cells are not functioning under a physiological range of substrates. Additional methods are therefore required to interrogate mitochondrial function in substrate concentrations that are more relevant to what cells experience in vivo.
Mitochondrial membrane potential (mMP) is the major component of a protonmotive force and is essential for a variety of mitochondrial processes beyond ATP production, such as regulation of respiratory flux, reactive oxygen species production, protein and ion import, autophagy, and apoptosis. mMP can be assessed with electrochemical probes or fluorescent dyes sensitive to changes in membrane polarization like JC-1, Rhod123, DiOC6, tetramethyl rhodamine (TMRE) or methyl ester (TMRM), and safranin. The latter two are lipophilic cationic dyes that have been successfully used in high-resolution fluorespirometry of tissue homogenates, isolated mitochondria, and permeabilized tissue11,29,30,31,32,33. In this technique, TMRM is used in quench mode, where cells are exposed to a high concentration of TMRM that accumulates in the mitochondrial matrix when polarized (high mMP and protonmotive force), resulting in the quenching of cytosolic TMRM fluorescence. When mitochondria depolarize in response to ADP or uncouplers, the dye is released from the matrix, increasing the TMRM fluorescent signal34,35. The purpose of this method is to simultaneously measure changes in mitochondrial respiration and mMP in response to ADP titrations in human-derived PBMCs, circulating monocytes, and T-cells, and it can also be applied to mouse splenic T-cells.

著者スポットライト:蛍光スピロメトリーを使用したPBMCミトコンドリア応答に関する新しい洞察

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

For a cell to function and survive following a period of physiological stress, it needs to be able to meet the energy demand required to restore homeostasis. In our lab, we seek to identify how mitochondria respond and adapt to nutritional stressors to better understand how mitochondria mediate the risk of developing disease. The current methods for testing PBMC bioenergetics involve measuring respiratory capacity after adding inhibitors and uncouplers.These methods have helped us understand significant bioenergetic changes in PBMCs in different disease states. Membrane potential is essential for ATP synthesis and regulates processes such as respiratory flux, reactive oxygen species, and autophagy. However, we still have limited knowledge about how mitochondrial respiration and membrane potential together respond to physiological substrate concentrations in PBMCs.The advantage of this technique is that it allows for an integrated analysis of mitochondrial membrane potential and oxygen consumption in human PBMCs in response to increasing levels of ADP. This method allows for the quantification of the sensitivity of mitochondria to a shift in energy demand.

アッセイの最適細胞濃度の違いを示すために、500万個のT細胞を1つの0.5 mLチャンバー(1,000万細胞/mL)にインロードし、125万個の細胞を1 μM TMRMを含む別のチャンバー(250万細胞/mL)にロードしました(図3A-G)。TMRMの背景を計算するために、3つのブランク実験も含まれていました。T細胞の濃度が高いほど、バックグラウンドと比較してTMRM蛍光の変化がより明確になることがわかりました(図3B、D)。さらに、細胞濃度が高いほど、FCCPの添加に応答して予想される酸素消費量の増加とmMPの同時枯渇を検出することができました(図3E、F)。低濃度の細胞を使用すると、背景と平行に蛍光に弱い変化が見られました。mMPの計算ではシグナルからバックグラウンドが差し引かれるため、セル濃度が低いと、基板やアンカプラーに応答したmMPの変化を測定できません。このアッセイでは、高濃度の細胞を使用することに加えて、実験間で各細胞タイプの細胞濃度を一定に保つことをお勧めします。
ADP滴定によるmMPの散逸におけるATP合成酵素の影響を検証するために、ADP滴定前に一方のチャンバーがオリゴマイシンを受入したPBMCおよびT細胞で並行実験を行いました(図4)。オリゴマイシンで処理した細胞では、ADPに応答したmMPの散逸は見られず、ADPによるmMPの漸進的な減少は、ATPシンターゼを介したプロトンフラックスの結果であることを示唆しています(図4A-F)。また、同じ参加者のT細胞とPBMCとの間のADP感度を比較し、T細胞画分ではADP感度が低い(EC50が高い)ことがわかりました(図4G、H)。
私たちは、TMRM蛍光に対する時間またはSUITプロトコルの影響を決定するために、一連のブランク実験を実施しました。ブランク実験のTMRM信号は、滴定のタイミング(図5B)ではなく、SUIT滴定(図5A)の影響をほとんど受けることがわかりました。
私たちは、11人の健康な地域住民のボランティアから、T細胞と単球における酸素消費率(OCR)とmMPのADPによる変化を比較しました(図6A-H)。細胞外フラックスおよび酵素アッセイを用いた以前に発表された実験の結果と同様に、単球はリンパ球26,27よりも大きなミトコンドリア呼吸能力を示した(図6A,H)。しかし、マウスの肝臓のような代謝性の高い組織を使用した場合にこの方法が示すものとは対照的に、どちらの細胞タイプでもADPによるOCRの典型的な用量反応の増加は検出されませんでした(図6C、D)。一方、TMRMを使用することで、ヒト免疫細胞(図6E-G)およびマウスの脾臓T細胞(図7E-H)でADPによるmMPの緩やかな減少を検出することができました。ヒトとマウスのT細胞を同じ滴定プロトコルを用いて直接比較したわけではありませんが、マウスT細胞のIC50は、ヒト被験者の循環T細胞と比較して10倍低いことがわかりました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig03v2.jpg"> 図3:高分解能蛍光スピロメトリー実験 (A-D) 0.5 mLチャンバー内のT細胞濃度1,000万細胞/mLおよび250万細胞/mLを使用した高分解能蛍光スピロメトリー実験のトレース。(A)0.5 mLチャンバーで1,000万細胞/mL。(C)0.5mLチャンバーで250万細胞/ mL。上部パネル(赤)に酸素フラックス(pmol/s/mL)、下部パネル(黒)にキャリブレーション済みTMRM信号が示されています。サンプルの SUIT 全体にわたる TMRM の変化と、その計算されたバックグラウンドを、(B)1,000 万細胞/mL および (D)250 万細胞/mL を含むチャンバーについてプロットしました。(E)各細胞濃度について、酸素フラックス(pmol/s/百万細胞)と(F)ミトコンドリア膜電位を算出した。(G)ADP感度曲線をプロットし、非線形回帰モデル(実線)に適合させた。略語:mMP、ミトコンドリア膜電位;TMRM、テトラメチルローダミンメチルエステル;SUIT、基板-アンカプラー-阻害剤滴定;ADP、アデノシン二リン酸;ディグ、ジギトニン;マル、リンゴ;ピル、ピルビン酸;グルート、グルタミン酸;D1-11、11連続ADP滴定。U、アンカプラーFCCPは0.5および1.0μM。AMA、アンチマイシンA.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig04v2.jpg"> 図4:ATP合成酵素は、T細胞およびPBMCにおけるADPによる膜電位の低下を促進する。2つのO2KチャンバーにPBMCを注入し、追加のO2Kの2つのチャンバーに同じ参加者のT細胞を注入しました。リンゴ酸、ピルビン酸、グルタミン酸の基質をすべてのチャンバーに注入した後、PBMCとT細胞の1つのチャンバーにオリゴマイシンを投与しました。オリゴマイシンは、(A)PBMCおよび(D)T細胞におけるADPによる呼吸の増加、または(B、C)PBMCおよび(E、F)T細胞におけるミトコンドリア膜電位の低下を防止しました。(G,H)ADP感度は、T細胞と比較してPBMCで高かった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig05v2.jpg"> 図5:ブランク実験は、基質、アンカプラー、および阻害剤(SUIT)の時間と滴定に応答したTMRM蛍光の変化を示しています。 (A)滴定応答性におけるTMRM蛍光の変化。(B)時間応答性TMRM蛍光の変化。実験は、1 μM TMRM を含む Mir05 で満たされた 0.5 mL チャンバーで行いました。1つのチャンバーはSUIT滴定を受けませんでした(注射なし)。2つの異なる器具の2つのチャンバーに、標準スーツプロトコル(標準注射)が投与されました。1 つのチャンバーは同じ SUIT 滴定を受けましたが、各注入の間に遅延がありました (遅延注入)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig06v2.jpg"> 図6:OCRとmMPを使用したT細胞と単球のADP感度の違い (A)被験者の単球とT細胞のサンプルからの高分解能蛍光スパイロメトリー実験の痕跡。(B)健康なボランティアの血液からの単球(n = 11)およびT細胞(n = 13)の酸素消費量。(C,D)プロットされた呼吸の増加と ADP 滴定の非線形回帰フィッティングにより、EC50 を算出します。(E)ミトコンドリア膜電位の同時測定。(F,G)IC50を計算するためのADP滴定によるミトコンドリア膜電位のプロットされた減少の非線形回帰フィッティング。(H)単球およびT細胞の呼吸能力のパラメータ。データは、折れ線グラフ±SEMの平均、棒グラフ±SDの平均で表されます。t検定後の統計的に有意な差は、*p < 0.05で表されます。**p < 0.01、****p < 0.0001 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig07v2.jpg"> 図7:透過処理されたマウス脾臓T細胞と肝臓の呼吸におけるADP応答とミトコンドリア膜電位(mMP)の比較(A-D)透過処理されたマウス脾臓T細胞と肝臓の呼吸における応答。(E-H)透過処理されたマウス脾臓T細胞および肝臓におけるmMPの応答。新鮮な肝臓と脾臓を、子宮頸部脱臼後の3匹のマウスから解剖しました。脾臓Pan T細胞は、抗体標識磁気ビーズ分離法を用いて単離しました。両方のサンプルは、1 μM TMRMの存在下で同じSUITプロトコルを受けました。(私、J)酸素消費量の増加から算出したEC50(OCR)と、ADPに反応してmMPが減少したEC50との比較。N = グループごとに 3。データは平均±SEMで表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:0.5mLチャンバーを使用して新たに単離されたT細胞および単球のミトコンドリア膜電位を評価するためのSUITプロトコルの例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:0.5 mLチャンバーの推奨ADP滴定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表3:5つの独立したブランク実験を使用した平均バックグラウンド比の計算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%203.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表4:サンプル実験からのミトコンドリア膜電位(mMP)の計算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%204.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:ミトコンドリア呼吸と膜電位に対するMir05とDMSOの影響。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementray%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:マウス脾臓からT細胞を単離するための試薬調製とプロトコール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementary%20FIle%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these ...

細胞が生理学的ストレスの期間を経て機能し、生き残るためには、ホメオスタシスを回復するために必要なエネルギー需要を満たすことができる必要があります。私たちの研究室では、ミトコンドリアが病気を発症するリスクをどのように媒介するかをよりよく理解するために、ミトコンドリアが栄養ストレッサーにどのように反応し、適応するかを特定しようとしています。PBMC生体エネルギーを試験する現在の方法には、阻害剤とアンカプラーを追加した後の呼吸容量の測定が含まれます。これらの方法は、さまざまな病状におけるPBMCの有意な生体エネルギー変化を理解するのに役立ちました。膜電位はATP合成に不可欠であり、呼吸フラックス、活性酸素種、オートファジーなどのプロセスを調節します。しかし、ミトコンドリアの呼吸と膜電位がPBMCの生理学的基質濃度にどのように反応するかについては、まだ知識が限られています。この手法の利点は、ADPレベルの増加に応答して、ヒトPBMCのミトコンドリア膜電位と酸素消費量の統合分析を可能にすることです。この方法により、エネルギー需要の変化に対するミトコンドリアの感度を定量化することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

632 ビュー.  University of Washington. 細胞が生理学的ストレスの期間を経て機能し、生き残るためには、ホメオスタシスを回復するために必要なエネルギー需要を満たすことができる必要があります。私たちの研究室では、ミトコンドリアが病気を発症するリスクをどのように媒介するかをよりよく理解するために、ミトコンドリアが栄養ストレッサーにどのように反応し、適応するかを特定しようとして?...