نود أن نشكر المتطوعين الطيبين الذين تبرعوا بالدم لهذا المشروع. كما نعرب عن خالص تقديرنا للدكتورة إلين شور وفريقها لتزويدنا بعينات إضافية من دراستهم. نود أيضا أن نشكر أندرو كيرش على مراجعة المخطوطة وتحريرها للتأكد من وضوحها. تم دعم هذا العمل من قبل مصادر التمويل التالية: P01AG001751 ، R01AG078279 ، P30AR074990 ، P30DK035816 ، P30DK017047 ، R01DK089036 ، K01HL154761 ، T32AG066574.

تحليل عالي الدقة لوظيفة الميتوكوندريا في PBMCs البشرية

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

يستخدم هذا البروتوكول قياس الفلورة عالي الدقة لقياس حساسية استجابة الميتوكوندريا للطلب على الطاقة عن طريق قياس تبديد mMP استجابة لزيادة مستويات ADP في PBMCs ، وحيدات ، والخلايا التائية. يتم ذلك عن طريق إضافة ركائز معقدة I و II لزيادة جهد غشاء الميتوكوندريا ومعايرة ADP لتحفيز ATP-synthase تدريجيا لاستخدام تدرج البروتون لتوليد ATP.
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول ضبط كسب وشدة الفلوروفور على 1000 والتأكد من الحصول على إشارة الفلورسنت TMRM أثناء معايرة TMRM. نظرا لأن مضان TMRM ينخفض بعد كل معايرة (أحد قيود هذه الطريقة) ، فمن الضروري إجراء تجارب الخلفية باستخدام عينات فارغة. لقد وجدنا أيضا أن DMSO له تأثير مثبط على التنفس الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء ، وبالتالي ، نوصي بتخفيف محلول عمل TMRM في Mir05 (الشكل التكميلي 1). 
بعض التعديلات التي يمكن استخدامها عند تجربة هذا البروتوكول هي ضبط تركيزات الخلايا واستخدام غرفة 2 مل القياسية. ومع ذلك ، فإن غرفة 0.5 مل مفضلة للخلايا التائية والوحيدات بسبب التركيز العالي للخلايا اللازمة للاستجابة المثلى في إمكانات الغشاء وتدفق الأكسجين. قد يكون التركيز المنخفض للخلايا هو الأمثل عند اختبار الخلايا ذات السعة التنفسية الأكبر ، مثل البلاعم.
تشمل القيود الإضافية للطريقة المعروضة هنا متطلبات ما لا يقل عن 5 ملايين خلية تائية و 2.5 مليون خلية وحيدة. يمكننا في كثير من الأحيان الحصول على خلايا كافية من ~ 20 مل من الدم من المشاركين الأصحاء ، ولكن هذه الأرقام يمكن أن تختلف حسب الحالة الصحية والعمر والجنس26. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو الحال في معظم طرق تقييم قدرة الميتوكوندريا ، يجب عزل الخلايا حديثا. ومع ذلك ، يمكن تجربة هذه الطريقة في الخلايا المحفوظة بالتبريد في المستقبل. بالمقارنة مع العائد من دم الإنسان ، فإن إنتاج الخلايا التائية من طحال الفئران السليمة مرتفع بما يكفي لإجراء هذا الفحص.
تعتمد الخلايا التائية المنتشرة ، وخاصة الذاكرة طويلة العمر (TM) والخلايا التنظيمية (Treg) ، على الفسفرة التأكسدية للحصول على الطاقة37. في حين أن الطلب على الطاقة واستهلاك الأكسجين منخفضان (على سبيل المثال ، مقارنة بعضلات الراحة) ، فإن بقائهم ضروري لاستجابة مناعية فعالة لإعادة العدوى والسرطان38،39،40. يؤدي انخفاض الفسفرة التأكسدية للخلايا التائية إلى ضعف القدرة التكاثرية ويعزز استنفاد الخلايا التائية والشيخوخة 5,41. بالإضافة إلى ذلك ، يعزز فرط استقطاب الميتوكوندريا الإنتاج المستدام للسيتوكينات (IL-4 و IL-21) بواسطة الخلايا التائية CD4 المستجيبة أثناء التنشيط42. عند الإصابة ، يمكن أن تصل متطلبات الطاقة لتنشيط وتكاثر الخلايا المناعية إلى 25٪ -30٪ من معدل الأيض الأساسي43. لذلك ، تعمل الخلايا المناعية في نطاق واسع ومتطرف من متطلبات الطاقة ، ويمكن لهذا البروتوكول اختبار استجابات الميتوكوندريا ضمن هذا النطاق.
الالتهاب المزمن هو سمة شائعة للسمنة والسكري والشيخوخة. المستويات غير المنظمة للهرمونات المنتشرة والدهون والجلوكوز لها تأثيرات جهازية وبالتالي يمكن أن تؤثر على كيفية استجابة الميتوكوندريا لتحدي نشط. هنا ، قدمنا طريقة لتقييم حساسية ADP للميتوكوندريا في تعميم PBMCs. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد كيفية تعديل حساسية ADP في أمراض التمثيل الغذائي وكيف تؤثر على الحالة الصحية.

تعتمد قدرة الخلية على العمل والبقاء على قيد الحياة في فترة الإجهاد الفسيولوجي إلى حد كبير على قدرتها على تلبية المتطلبات النشطة لاستعادة التوازن 1,2. يرتفع الطلب على الطاقة استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات. على سبيل المثال ، زيادة تقلص العضلات أثناء التمرين يزيد من استخدام ATP والجلوكوز بواسطة العضلات الهيكلية ، ويزيد ارتفاع تخليق البروتين بعد الإصابة من استخدام ATP من قبل الخلايا المناعية لإنتاج السيتوكين وانتشاره3،4،5،6. يؤدي الارتفاع الحاد في الطلب على الطاقة إلى سلسلة من عمليات الطاقة الحيوية لاستعادة نسبة ATP / ADP. عند استهلاك ATP ، ترتفع مستويات ADP وتحفز F1F0 ATP-synthase (المركب V) ، الأمر الذي يتطلب قوة دافعة بروتونية لدفع دورانه الميكانيكي والتحويل التحفيزي ل ADP إلى ATP داخل الميتوكوندريا7. القوة الدافعة البروتونية هي تدرج كهروكيميائي تم إنشاؤه عن طريق ضخ البروتونات أثناء نقل الإلكترونات من الركائز إلى الأكسجين من خلال نظام نقل الإلكترون (ETS) داخل غشاء الميتوكوندريا الداخلي. يخلق الاختلاف الناتج في تركيز البروتون (دلتا pH) والإمكانات الكهربائية (جهد الغشاء) القوة الدافعة البروتونية التي تدفع تخليق ATP واستهلاك الأكسجين استجابة للطلب على الطاقة مما يقلل من نسبة ATP / ADP أو يرفع مستويات ADP. يمكن تحديد تقارب الميتوكوندريا مع ADP من خلال حساب Km أو EC50 للتنفس المحفز ADP للميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا المتداخلة 8,9. أظهرت هذه الطريقة أن الألياف العضلية المتداخلة من البشر الأكبر سنا تتطلب تركيزا أكبر من ADP لتحفيز 50٪ من قدرتها القصوى على الفسفرة التأكسدية مقارنة بالأشخاص الأصغر سنا9. وبالمثل ، تتطلب شيخوخة العضلات الهيكلية للفأر المزيد من ADP لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية للميتوكوندريا (ROS) 10,11. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل حساسية ADP في ألياف العضلات المتداخلة للفئران المصابة بالسمنة التي يسببها النظام الغذائي بالنسبة إلى الضوابط ويتم تعزيزها في وجود الأنسولين وبعد استهلاك النترات 12,13. وبالتالي ، فإن قدرة الميتوكوندريا على الاستجابة للطلب على الطاقة تختلف في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة ، ولكن لم يتم استكشاف ذلك من قبل في سياق الخلايا المناعية.
تستخدم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) بشكل شائع للتحقيق في الطاقة الحيوية الخلوية في البشر14،15،16،17،18،19،20. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة الحصول على الخلايا من عينات الدم غير المتخثرة في الدراسات السريرية ، واستجابة الخلايا للاضطرابات الأيضية ، والأساليب التي طورتها مجموعات مختلفة لاستجواب استقلاب الميتوكوندريا باستخدام مثبطات و uncouplers لتحديد السعة القصوى والحد الأدنى لتنفس الميتوكوندريا21,22. وقد أدت هذه الأساليب إلى تقدير أدوار الطاقة الحيوية في الشيخوخة ، وأمراض التمثيل الغذائي ، ووظيفة المناعة14،20،23،24. غالبا ما يتم تقليل القدرة التنفسية للميتوكوندريا في العضلات الهيكلية و PBMCs في ظل ظروف قصور القلب18,25. ترتبط الطاقة الحيوية PBMC أيضا بعوامل الخطر القلبية الأيضية لدى البالغين الأصحاء17 وتستجيب لعلاجات مثل نيكوتيناميد ريبوسيد18. تشمل PBMCs العدلات والخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية) والوحيدات والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة ، والتي تساهم جميعها في قدرة الميتوكوندريا PBMC26،27،28. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الطاقة الحيوية الخلوية دورا حاسما في تنشيط الخلايا المناعية وتكاثرها وتجديدها23. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطرق هو أن الخلايا لا تعمل تحت نطاق فسيولوجي من الركائز. لذلك هناك حاجة إلى طرق إضافية لاستجواب وظيفة الميتوكوندريا في تركيزات الركيزة الأكثر صلة بما تختبره الخلايا في الجسم الحي.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) هي المكون الرئيسي للقوة الدافعة للبروتونية وهي ضرورية لمجموعة متنوعة من عمليات الميتوكوندريا التي تتجاوز إنتاج ATP ، مثل تنظيم تدفق الجهاز التنفسي ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، واستيراد البروتين والأيونات ، والالتهام الذاتي ، وموت الخلايا المبرمج. يمكن تقييم mMP باستخدام مجسات كهروكيميائية أو أصباغ فلورية حساسة للتغيرات في استقطاب الغشاء مثل JC-1 و Rhod123 و DiOC6 ورباعي ميثيل رودامين (TMRE) أو ميثيل استر (TMRM) وسافرانين. الأخيران هما أصباغ كاتيونية محبة للدهون تم استخدامها بنجاح في قياس الفلورة عالي الدقة لمتجانسات الأنسجة ، والميتوكوندريا المعزولة ، والأنسجة النفاذية11،29،30،31،32،33. في هذه التقنية ، يتم استخدام TMRM في وضع التبريد ، حيث تتعرض الخلايا لتركيز عال من TMRM الذي يتراكم في مصفوفة الميتوكوندريا عند الاستقطاب (ارتفاع mMP والقوة الدافعة) ، مما يؤدي إلى إخماد مضان TMRM الخلوي. عندما تزيل الميتوكوندريا استقطابها استجابة ل ADP أو uncouplers ، يتم إطلاق الصبغة من المصفوفة ، مما يزيد من إشارة الفلورسنت TMRM34,35. الغرض من هذه الطريقة هو قياس التغيرات في تنفس الميتوكوندريا و mMP في وقت واحد استجابة لمعايرة ADP في PBMCs المشتقة من الإنسان ، والوحيدات المنتشرة ، والخلايا التائية ، ويمكن أيضا تطبيقها على الخلايا التائية الطحالية للفأر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine Diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td>Isolation of T-cells from mouse spleen protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-101</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>Version 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Set AmR</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>44321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque 1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA blood collection tubes</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
			<td>366643</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>153516</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Malic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride&#160;(MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-MACS stand and MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Fluo Smart-Module</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>12100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-FluoRespirometer series J</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>10201-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-sV-Module (0.5 chamber)</td>
			<td>Oroboros</td>
			<td>11200-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04876</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130095130</td>
			<td>Isolation of T-cells from mouse spleen protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide&#160;(KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Mir05 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5428</td>
			<td>Fluorespirometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution fluorespirometry to assess dynamic changes in mitochondrial membrane potential in human immune cells

تظهر الخلايا أحادية النواة المحيطية (PBMCs) تغيرات قوية في القدرة التنفسية للميتوكوندريا استجابة للصحة والمرض. في حين أن هذه التغييرات لا تعكس دائما ما يحدث في الأنسجة الأخرى ، مثل العضلات الهيكلية ، فإن هذه الخلايا هي مصدر قيم يمكن الوصول إليه للميتوكوندريا القابلة للحياة من البشر. تتعرض PBMCs لإشارات نظامية تؤثر على حالة الطاقة الحيوية الخاصة بها. وبالتالي ، فإن توسيع أدواتنا لاستجواب استقلاب الميتوكوندريا في هذه الفئة من السكان سيوضح الآليات المتعلقة بتطور المرض. غالبا ما تقتصر المقايسات الوظيفية للميتوكوندريا على استخدام مخرجات الجهاز التنفسي بعد تركيزات الركيزة القصوى والمثبطات وغير المقرنة لتحديد النطاق الكامل للقدرة التنفسية ، والتي قد لا يمكن تحقيقها في الجسم الحي. يؤدي تحويل أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة ATP-synthase إلى انخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) وزيادة في استهلاك الأكسجين. لتوفير تحليل أكثر تكاملا لديناميكيات الميتوكوندريا ، توضح هذه المقالة استخدام قياس الفلورة عالي الدقة لقياس الاستجابة المتزامنة لاستهلاك الأكسجين وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) لتركيزات ADP ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تستخدم هذه التقنية رباعي ميثيل رودامين ميثيل إستر (TMRM) لقياس استقطاب mMP استجابة لمعايرة ADP بعد فرط الاستقطاب الأقصى مع ركائز معقدة I و II. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد كيفية تأثير التغيرات في الحالة الصحية ، مثل الشيخوخة وأمراض التمثيل الغذائي ، على حساسية استجابة الميتوكوندريا للطلب على الطاقة في PBMCs والخلايا التائية والوحيدات من البشر.

A cell&#39;s ability to function and survive in a period of physiological stress is largely dependent on its ability to meet the energetic requirement to restore homeostasis1,2. Energy demand rises in response to a variety of stimuli. For instance, increased muscle contraction during exercise increases the utilization of ATP and glucose by skeletal muscle, and a rise in protein synthesis following infection increases the utilization of ATP by immune cells for cytokine production and proliferation3,4,5,6. A spike in energy demand triggers a series of bioenergetic processes to restore the ATP/ADP ratio. As ATP is consumed, ADP levels rise and stimulate F1F0&#160;ATP-synthase (complex V), which requires a protonmotive force to drive its mechanical rotation and catalytic conversion of ADP to ATP within the mitochondrion7. The protonmotive force is an electrochemical gradient created by the pumping of protons during the transfer of electrons from substrates to oxygen through the electron transport system (ETS) within the inner mitochondrial membrane. The resulting difference in proton concentration (delta pH) and electrical potential (membrane potential) creates the protonmotive force that drives ATP synthesis and oxygen consumption in response to energy demand reducing the ATP/ADP ratio or raising ADP levels. The affinity of mitochondria to ADP can be determined by the calculation of the Km or EC50 of ADP-stimulated respiration of isolated mitochondria or permeabilized cells8,9. This method has shown that permeabilized muscle fibers from older humans require a greater concentration of ADP to stimulate 50% of their maximal oxidative phosphorylation capacity than those of younger subjects9. Similarly, aging mouse skeletal muscle requires more ADP to lower the production of mitochondrial reactive oxygen species (ROS)10,11. Additionally, ADP sensitivity is reduced in permeabilized muscle fibers of mice with diet-induced obesity relative to controls and is enhanced in the presence of insulin and following nitrate consumption12,13. Thus, the capacity of mitochondria to respond to energy demand varies under different physiological conditions, but this has not been previously explored in the context of immune cells.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are commonly used to investigate cellular bioenergetics in human subjects14,15,16,17,18,19,20. This is largely due to cells being easily obtainable from uncoagulated blood samples in clinical studies, the responsiveness of cells to metabolic perturbations, and the methods developed by various groups to interrogate mitochondrial metabolism by using inhibitors and uncouplers to determine the maximal and minimal capacity of mitochondrial respiration21,22. These methods have led to an appreciation of the roles of bioenergetics in aging, metabolic disease, and immune function14,20,23,24. Mitochondrial respiratory capacity is often reduced in skeletal muscle and PBMCs under conditions of heart failure18,25. PBMC bioenergetics are also correlated with cardiometabolic risk factors in healthy adults17 and are responsive to treatments such as nicotinamide riboside18. PBMCs include neutrophils, lymphocytes (B-cells and T-cells), monocytes, natural killer cells, and dendritic cells, which all contribute to PBMC mitochondrial capacity26,27,28. In addition, cellular bioenergetics play a crucial role in immune cell activation, proliferation, and renewal23. However, a limitation of these methods is that the cells are not functioning under a physiological range of substrates. Additional methods are therefore required to interrogate mitochondrial function in substrate concentrations that are more relevant to what cells experience in vivo.
Mitochondrial membrane potential (mMP) is the major component of a protonmotive force and is essential for a variety of mitochondrial processes beyond ATP production, such as regulation of respiratory flux, reactive oxygen species production, protein and ion import, autophagy, and apoptosis. mMP can be assessed with electrochemical probes or fluorescent dyes sensitive to changes in membrane polarization like JC-1, Rhod123, DiOC6, tetramethyl rhodamine (TMRE) or methyl ester (TMRM), and safranin. The latter two are lipophilic cationic dyes that have been successfully used in high-resolution fluorespirometry of tissue homogenates, isolated mitochondria, and permeabilized tissue11,29,30,31,32,33. In this technique, TMRM is used in quench mode, where cells are exposed to a high concentration of TMRM that accumulates in the mitochondrial matrix when polarized (high mMP and protonmotive force), resulting in the quenching of cytosolic TMRM fluorescence. When mitochondria depolarize in response to ADP or uncouplers, the dye is released from the matrix, increasing the TMRM fluorescent signal34,35. The purpose of this method is to simultaneously measure changes in mitochondrial respiration and mMP in response to ADP titrations in human-derived PBMCs, circulating monocytes, and T-cells, and it can also be applied to mouse splenic T-cells.

تسليط الضوء على المؤلف: رؤى جديدة حول استجابات الميتوكوندريا PBMC باستخدام قياس الفلورة

قياس الفلورة عالي الدقة لتقييم التغيرات الديناميكية في إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا المناعية البشرية

For a cell to function and survive following a period of physiological stress, it needs to be able to meet the energy demand required to restore homeostasis. In our lab, we seek to identify how mitochondria respond and adapt to nutritional stressors to better understand how mitochondria mediate the risk of developing disease. The current methods for testing PBMC bioenergetics involve measuring respiratory capacity after adding inhibitors and uncouplers.These methods have helped us understand significant bioenergetic changes in PBMCs in different disease states. Membrane potential is essential for ATP synthesis and regulates processes such as respiratory flux, reactive oxygen species, and autophagy. However, we still have limited knowledge about how mitochondrial respiration and membrane potential together respond to physiological substrate concentrations in PBMCs.The advantage of this technique is that it allows for an integrated analysis of mitochondrial membrane potential and oxygen consumption in human PBMCs in response to increasing levels of ADP. This method allows for the quantification of the sensitivity of mitochondria to a shift in energy demand.

لتوضيح الاختلافات في تركيز الخلايا الأمثل للفحص ، تم تحميل 5 ملايين خلية تائية في غرفة واحدة سعة 0.5 مل (10 ملايين خلية / مل) ، وتم تحميل 1.25 مليون خلية في غرفة أخرى (2.5 مليون خلية / مل) تحتوي على 1 ميكرومتر TMRM (الشكل 3A-G). كما أدرجت ثلاث تجارب فارغة لحساب خلفية آلية استعراض آلية استعراض الأسلحة المؤقتة. وجدنا أن التركيز العالي للخلايا التائية أدى إلى تغيير أكثر وضوحا في مضان TMRM بالنسبة للخلفية (الشكل 3B ، D). بالإضافة إلى ذلك ، سمح لنا تركيز الخلية العالي باكتشاف الزيادة المتوقعة في استهلاك الأكسجين والنضوب المتزامن ل mMP استجابة لإضافة FCCP (الشكل 3E ، F). أدى استخدام تركيز منخفض من الخلايا إلى تغيير ضعيف في التألق الموازي للخلفية. نظرا لأن حساب mMP يطرح الخلفية من الإشارة ، فإن تركيز الخلية المنخفض لا يسمح بتحديد التغييرات في mMP استجابة للركائز وأجهزة فك التوصيل. بالإضافة إلى استخدام التركيزات الأعلى للخلايا في هذا الفحص ، نوصي بالحفاظ على تركيز الخلية ثابتا لكل نوع خلية بين التجارب.
للتحقق من تأثير ATP-synthase في تبديد mMP مع معايرة ADP ، أجرينا تجارب متوازية على PBMCs والخلايا التائية حيث تلقت غرفة واحدة oligomycin قبل معايرة ADP (الشكل 4). لم نجد أي تبديد ل mMP استجابة ل ADP في الخلايا المعالجة بقليل الميزوميسين ، مما يشير إلى أن الانخفاض التدريجي في mMP مع ADP هو نتيجة لتدفق البروتون من خلال ATP-synthase (الشكل 4A-F). قارنا أيضا حساسية ADP بين الخلايا التائية و PBMCs لنفس المشارك ووجدنا أن حساسية ADP أقل (أعلى EC50) في جزء الخلايا التائية (الشكل 4G ، H).
أجرينا سلسلة من التجارب الفارغة لتحديد تأثير الوقت أو بروتوكول SUIT على مضان TMRM. وجدنا أن إشارة TMRM في التجارب الفارغة تتأثر في الغالب بمعايرة SUIT (الشكل 5A) بدلا من توقيت المعايرات (الشكل 5B).
قارنا التغيرات المدفوعة ب ADP في معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) وفي mMP في الخلايا التائية والوحيدات من 11 متطوعا صحيا يسكنون المجتمع (الشكل 6A-H). على غرار نتائج التجارب المنشورة سابقا باستخدام التدفق خارج الخلية والمقايسات الأنزيمية ، أظهرت الخلايا الوحيدة قدرة تنفسية أكبر للميتوكوندريا من الخلايا الليمفاوية26,27 (الشكل 6A ، H). ومع ذلك ، لم نكتشف زيادة نموذجية في الاستجابة للجرعة في التعرف الضوئي على الحروف مع ADP في أي من نوعي الخلايا (الشكل 6C ، D) ، على عكس ما تظهره هذه الطريقة عند استخدام الأنسجة الأيضية العالية مثل كبد الفأر (الشكل 7A-H). من ناحية أخرى ، سمح لنا استخدام TMRM باكتشاف انخفاض تدريجي في mMP مع ADP في الخلايا المناعية البشرية (الشكل 6E-G) وفي الخلايا التائية الطحالية من الفئران (الشكل 7E-H). على الرغم من أننا لم نقارن مباشرة الخلايا التائية البشرية والفأرية باستخدام نفس بروتوكول المعايرة ، فقد وجدنا أن IC50 للخلايا التائية للفأر كان أقل بعامل 10 مقارنة بالخلايا التائية المنتشرة من البشر.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig03v2.jpg"> الشكل 3: تجارب قياس الفلورة عالية الاستبانة. (A-D) تتبع تجارب قياس الفلورة عالية الدقة باستخدام تركيزات الخلايا التائية من 10 ملايين خلية / مل و 2.5 مليون خلية / مل في غرف 0.5 مل. أ: 10 ملايين خلية/مل في حجرات سعة 0.5 مل. ج: 2.5 مليون خلية/مل في حجرات سعة 0.5 مل. يظهر تدفق الأكسجين (pmol / s / mL) في اللوحة العلوية (أحمر) ، وتظهر إشارة TMRM المعايرة في اللوحة السفلية (أسود). تم رسم التغييرات في TMRM في جميع أنحاء SUIT للعينة وخلفيتها المحسوبة للغرف التي تحتوي على (B) 10 ملايين خلية / مل و (D) 2.5 مليون خلية / مل. (ه) لكل تركيز خلية، تم حساب تدفق الأكسجين (pmol/s/million خلية) وجهد غشاء الميتوكوندريا (F). (ز) تم رسم منحنى حساسية ADP وملاءمته لنموذج الانحدار غير الخطي (الخطوط الصلبة). الاختصارات: mMP, غشاء الميتوكوندريا المحتملة; TMRM ، رباعي ميثيل رودامين ميثيل استر ؛ SUIT ، معايرة مثبطات الركيزة ؛ ADP ، أدينوسين ثنائي الفوسفات. حفر ، ديجيتونين. مال ، مالات. بير ، البيروفات. تخمة ، الغلوتامات. D1-11، 11 معايرة متتالية للفريق العامل المخصص المعني بالتنمية (ADP)؛ U ، فك اقتران FCCP من 0.5 و 1.0 ميكرومتر ؛ AMA ، أنتيميسين أ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig04v2.jpg"> الشكل 4: يؤدي ATP-synthase إلى انخفاض جهد الغشاء المدفوع ب ADP في الخلايا التائية و PBMCs. (أ-ح) تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا في PBMCs والخلايا التائية. تم حقن غرفتين O2K مع PBMCs ، وتم حقن غرفتين من O2K إضافية بخلايا T من نفس المشارك. بعد حقن ركائز مالات ، بيروفات ، وغلوتامات في جميع الغرف ، تلقت غرفة واحدة من PBMCs والخلايا التائية oligomycin. منع Oligomycin أي ارتفاع مدفوع ب ADP في التنفس في (A) PBMCs و (D) الخلايا التائية أو انخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا في (B ، C) PBMCs و (E ، F) الخلايا التائية. (ز ، ح) كانت حساسية ADP أكبر في PBMCs مقارنة بالخلايا التائية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig05v2.jpg"> الشكل 5: تظهر التجارب الفارغة التغير في مضان TMRM استجابة للوقت ومعايرة الركائز وأجهزة فك التوصيل والمثبطات (SUIT). (أ) التغير في مضان TMRM استجابة للمعايرة. (ب) التغير في مضان TMRM استجابة للوقت. أجريت التجارب في غرف 0.5 مل مملوءة ب Mir05 تحتوي على 1 ميكرومتر TMRM. لم تتلق غرفة واحدة أي معايرة SUIT (بدون حقن) ؛ تلقت غرفتان في صكين مختلفين بروتوكول بدلة قياسي (حقن قياسي) ؛ تلقت غرفة واحدة نفس معايرة SUIT ولكن مع تأخير بين كل حقنة (الحقن المتأخر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig06v2.jpg"> الشكل 6: الاختلافات في حساسية ADP بين الخلايا التائية والوحيدات باستخدام OCR و mMP. (أ) تتبع تجربة قياس الفلورة عالية الدقة من عينة الخلية الوحيدة والخلايا التائية للموضوع. (ب) استهلاك الأكسجين في الخلايا الوحيدة (ن = 11) والخلايا التائية (ن = 13) من دم المتطوعين الأصحاء. (ج، د) تركيب الانحدار غير الخطي للارتفاع المرسوم في التنفس باستخدام معايرة ADP لحساب EC50. ه: القياس المتزامن لجهد غشاء الميتوكوندريا. (و ، ز) تركيب الانحدار غير الخطي للانخفاض المرسوم في إمكانات غشاء الميتوكوندريا مع معايرة ADP لحساب IC50. (ح) بارامترات القدرة التنفسية للوحيدات والخلايا التائية. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM للرسوم البيانية الخطية ومتوسط ± SD للرسوم البيانية الشريطية. يتم التعبير عن الفروق ذات الدلالة الإحصائية بعد اختبارات t ك * p < 0.05. ** p < 0.01 ، و **** p < ل 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig07v2.jpg"> الشكل 7: مقارنة استجابة جزيء ADP في التنفس وجهد غشاء الميتوكوندريا (mMP) في الخلايا التائية الطحالية للفأر والكبد. (A-D) الاستجابة في التنفس في الخلايا التائية الطحالية للفأر النفاذية والكبد. (ه-ح) الاستجابة في mMP في الخلايا التائية الطحالية للفأر المتغلغلة والكبد. تم تشريح الكبد الطازج والطحال من ثلاثة فئران بعد خلع عنق الرحم. تم عزل الخلايا التائية الطحالية باستخدام فصل الحبيبات المغناطيسية المترافقة بالأجسام المضادة. خضعت كلتا العينتين لنفس بروتوكول SUIT في وجود 1 μM TMRM. (ط، ي) مقارنة EC50 محسوبة من الزيادة في استهلاك الأكسجين (OCR) و IC50 من الانخفاض في mMP استجابة ل ADP. N = 3 لكل مجموعة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: مثال على بروتوكول SUIT لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا التائية المعزولة حديثا والوحيدات باستخدام غرف 0.5 مل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: معايرة ADP الموصى بها لحجرة 0.5 مل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%202.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: حساب متوسط نسبة الخلفية باستخدام خمس تجارب فارغة مستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%203.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 4: حساب جهد غشاء الميتوكوندريا (mMP) من تجربة العينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%204.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الشكل التكميلي 1: تأثير Mir05 و DMSO على تنفس الميتوكوندريا وجهد الغشاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementray%20Figure%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: إعداد الكاشف وبروتوكول عزل الخلايا التائية من طحال الفأر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementary%20FIle%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

طرق دراسة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا تحت تركيزات الركيزة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الخلايا المناعية محدودة. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا يستخدم قياس الفلور عالي الدقة لتقييم التغيرات في استجابة غشاء الميتوكوندريا المحتمل للطلب على الطاقة في الخلايا التائية البشرية ، وحيدات الخلايا ، والخلايا أحادية النواة المحيطية.

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these ...

لكي تعمل الخلية وتبقى على قيد الحياة بعد فترة من الإجهاد الفسيولوجي، يجب أن تكون قادرة على تلبية الطلب على الطاقة اللازم لاستعادة الاتزان الداخلي. في مختبرنا ، نسعى إلى تحديد كيفية استجابة الميتوكوندريا والتكيف مع الضغوطات الغذائية لفهم أفضل لكيفية توسط الميتوكوندريا في خطر الإصابة بالمرض. تتضمن الطرق الحالية لاختبار الطاقة الحيوية PBMC قياس القدرة التنفسية بعد إضافة مثبطات ومفككات.وقد ساعدتنا هذه الطرق على فهم التغيرات الكبيرة في الطاقة الحيوية في PBMCs في حالات مرضية مختلفة. تعد إمكانات الغشاء ضرورية لتخليق ATP وتنظم عمليات مثل تدفق الجهاز التنفسي وأنواع الأكسجين التفاعلية والالتهام الذاتي. ومع ذلك ، لا يزال لدينا معرفة محدودة حول كيفية استجابة تنفس الميتوكوندريا وجهد الغشاء معا لتركيزات الركيزة الفسيولوجية في PBMCs.ميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء تحليل متكامل لإمكانات غشاء الميتوكوندريا واستهلاك الأكسجين في PBMCs البشرية استجابة لمستويات متزايدة من ADP. تسمح هذه الطريقة بالقياس الكمي لحساسية الميتوكوندريا للتحول في الطلب على الطاقة.

high-resolution-fluorespirometry-to-assess-dynamic-changes

Research

JoVE Journal

Biology

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

645 Views.  University of Washington. لكي تعمل الخلية وتبقى على قيد الحياة بعد فترة من الإجهاد الفسيولوجي، يجب أن تكون قادرة على تلبية الطلب على الطاقة اللازم لاستعادة الاتزان الداخلي. في مختبرنا ، نسعى إلى تحديد كيفية استجابة الميتوكوندريا والتكيف مع الضغوطات الغذائية لفهم أفضل لكيفية توسط الميتوكوندريا في ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: رؤى جديدة حول استجابات الميتوكوندريا PBMC باستخدام قياس الفلورة

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these changes&#160;do not always reflect what occurs in other tissues, such as skeletal muscle, these cells are an accessible and valuable source of viable mitochondria from human subjects. PBMCs are exposed to systemic signals that impact their bioenergetic state. Thus, expanding our tools to interrogate mitochondrial metabolism in this population will elucidate mechanisms related to disease progression. Functional assays of mitochondria are often limited to using respiratory outputs following maximal substrate, inhibitor, and uncoupler concentrations to determine the full range of respiratory capacity, which may not be achievable in vivo. The conversion of adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) by ATP-synthase results in a decrease in mitochondrial membrane potential (mMP) and an increase in oxygen consumption. To provide a more integrated analysis of mitochondrial dynamics, this article describes the use of high-resolution fluorespirometry to measure the simultaneous response of oxygen consumption and mitochondrial membrane potential (mMP) to physiologically relevant concentrations of ADP. This technique uses tetramethylrhodamine methylester (TMRM) to measure mMP polarization in response to ADP titrations following maximal hyperpolarization with complex I and II substrates. This technique can be used to quantify how changes in health status, such as aging and metabolic disease, affect the sensitivity of mitochondrial response to energy demand in PBMCs, T-cells, and monocytes from human subjects.

Methods for studying mitochondrial bioenergetics under physiologically relevant substrate concentrations in immune cells are limited. We provide a detailed protocol that uses high-resolution fluorespirometry to assess changes in the response of the mitochondrial membrane potential to energy demand in human T-cells, monocytes, and peripheral mononuclear cells.