極低温物質サンプル調製は、その有効性を制限する可能性のある課題、特に粒子分布の不均一性に直面しています。この問題は、多くの場合、新しく構築されたタンパク質構造の分解能の低下や精度の低下につながります。不均一な粒子分布を克服するために、サンプルへの界面活性剤や膜模倣物の追加、グリッドサポートフィルムの変更、データ収集中の特定のステージの傾けなど、さまざまな実験的アプローチが使用されます。
このプロトコールは、サンプル調製の最適化を通じて不均一な粒子分布に対処するためのシンプルで実用的な方法を分析し、研究者が極低温剤を使用して高分子構造を効率的に説明するための参考資料を提供します。まず、MJ低分子熱ショックタンパク質16.5を含むプールタンパク質画分を採取します。分子量カットオフが50キロダルトンの遠心フィルターを使用して、摂氏4度の画分を約65ミリグラムに濃縮します。
濃縮後、サンプルを16, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、凝集体を除去します。50マイクロリットルの容量の上清を0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブに分注します。透過型電子顕微鏡では、凍結した2本のタンパク質チューブを氷上で解凍します。
解凍したら、チューブを数回フリックして混ぜます。次に、タンパク質溶液を16, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、凝集体を除去します。次に、上清をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入し、0.5ミリリットルの溶出画分を収集します。
ピークに対応するelucianフラクションを収集し、280ナノメートルで最高の紫外線吸光度を示します。バッファー交換には、ハサミで透析膜を30×30mmにカットします。蒸留水または緩衝液でインキュベートし、平衡化します。
次に、50マイクロリットルのマイクロダイアリシスボタンを備えたチャンバーに55マイクロリットルのタンパク質溶液を追加します。鉗子を使用して透析膜を垂直に保持し、膜の一方の端をティッシュペーパーにそっと触れて、余分な液体を排出します。マイクロダイアリシスボタンをメンブレンで慎重に覆います。
Oリングを透析膜の上に置き、ボタンの端の溝にそっと転がします。各透析ボタンを、メンブレン側を上に向けて目的のバッファーを含む別々のビーカーに浸します。細い針付きのシリンジを使用して、メンブレンを慎重に打ち抜き、マイクロダイアリシスチャンバーからタンパク質溶液を回収します。
サンプルの5マイクロリットルをミリリットルあたり20〜120ナノグラムの濃度でグロー放電グリッドにロードします。パラフィンフィルムシート上に50マイクロリットルの水滴を3滴調製します。グリッド表面を水滴にこすりつけてサンプルを洗います。
次に、ろ過した1%酢酸小便器溶液を5マイクロリットルグリッドにロードし、すぐに酢酸小便器溶液をピペットで取り出します。さらに5マイクロリットルの小便器用アセテート溶液をグリッドにロードします。グリッドのピンセット側に濾紙でそっと触れて余分な染色液を取り除き、グリッドを乾かします。
ピンセットとグロー放電グリッドアセンブリを機器に取り付けます。次に、4マイクロリットルのサンプルをグリッドのカーボン側にロードします。プランジ凍結プロセスを開始します。
透過型電子顕微鏡(TEM)にロードするグリッドを準備するには、まずガラス化グリッドを含むグリッドボックスを自動グリッド組立ステーションに配置し、ガラス化グリッドを含むグリッドボックスの蓋を緩めます。オートグリッドリングを組立ステーションの指定された切り欠きスペースに配置します。ビトリファイドグリッドをグリッドボックスから慎重に移動し、自動グリッドリングの内側に取り付けます。
次に、ディスクの位置を合わせて、円形の開口部を自動グリッドリングとグリッドアセンブリの上に配置します。グリッドをオートグリッドリングに固定するには、Cクリップ挿入ツールをグリッドの上に置き、Cクリップを軽く押し下げて内部に固定します。ディスクを回転させて戻し、組み立てたグリッドを自動グリッドストレージボックスに移動します。
カセットローディングステーションを組み立て、液体窒素で冷却します。オートグリッドストレージボックスをローディングステーションに配置します。グリッドアセンブリを自動グリッドストレージボックスからカセットに移動します。
ハンドルを使用して、カセットをオートローダーカプセルに入れます。オートローダーのピンをチェックして、ピンが自由に動き、凍結していないことを確認します。アレイ内の粒子の蓄積は、バッファ条件や表面電荷の変更に関係なく、テストしたすべてのグリッドで観察されました。
9ミリモルのmobstress、50ミリモルの塩化ナトリウム、および0.1ミリモルのEDTAバッファーの負に帯電したグリッドと組み合わせた高いタンパク質濃度により、グリッドホール内に単一粒子が望ましい分布になり、タンパク質アレイの形成が減少しました。この最適化された条件により、円錐形のFSC面積比値は0.80、SCF値は0.859と高く、均一な粒子分布が確認されました。
