インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

当研究室では、ショウジョウバエをモデル生物として、化学物質の検出から行動への影響まで、味覚情報が神経回路を通じてどのように処理されているかを研究しています。このイメージングプロトコルを使用して、アミノ酸に応答する味覚細胞を特定し、さまざまな内部状態がこれらの必須栄養素に対する味細胞の応答を調節するかどうかを判断しています。このカルシウムイメージングアプローチの利点は、内部状態が損なわれていない覚醒した動物の特定の細胞から味覚誘発性神経応答を記録できることです。

私たちは現在、新しいショウジョウバエの全脳コネクトームの推定味覚回路を特定し、このカルシウムイメージングアプローチを使用してin vivoで機能的なニューロンダイナミクスを検証できます。まず、麻酔をかけたハエを解剖顕微鏡の下に置きます。解剖ハサミを使用して、大腿骨脛骨関節の中脚と後脚、転子の4本の脚を取り外します。

鈍い鉗子を使用して翼でフライを拾い上げ、体を下に保ちながら、頭をイメージングチャンバーの標的子宮頸部スロットの上に配置します。はさみと鈍い鉗子の鈍い面を使用して、頭と胸部を同時にスロットにそっと押し込みます。フライがスロットにしっかりと収まったら、フライを後ろに押して、チャンバーの正面を向くようにゆっくりと位置を変えます。

つまようじの先にマニキュアの小さな液滴を集め、ハエの頭をイメージングチャンバーに固定するために薄いコートを塗ります。片手でワックスを手に取り、先端にワックスの小さな液滴を集めます。一方、セミシャープな鉗子を使用して、1つの上顎の触手をつかみ、テングを完全に伸ばしてゆっくりと引き出して保持します。

ワックスが流れ始めるまで、ワックスの先端をテングの基部近くのチャンバーに接触させます。テングの基部とワックスをシャフトの途中まで接触するように移動し、ラベルセンシリとの接触を避けます。次に、テングをできるだけまっすぐに完全に伸ばします。

次に、取り付けられたハエを湿度チャンバーに60分間入れて回復します。湿度チャンバーからハエを取り出します。非常に鋭い鉗子を使用して、両方のアンテナをつまみ、キューティクルをつまんで穴を開け、鋭い鉗子の片側を挿入します。

鉗子をキューティクルの下に走らせて、関心のある脳領域を覆う領域から鉗子を取り除きます。露出した脳を洗うには、約100マイクロリットルの人工血リンパ液(AHL)を頭に加えます。洗濯後、AHLをはがし、脳が乾燥するのを防ぐために薄い層を残します。

鋭利な鉗子を使用して、エアバッグと脳を覆っている大きな破片を取り除きます。食道下ゾーン(SEZ)を具体的に画像化するには、非常に鋭い鉗子を使用して、吻の近くの基部と脳を通過するポイントで食道を切断します。このピースを取り外すと、SEZが露出します。

解剖顕微鏡の下で、10 x 20 mmのカバースリップをイメージングチャンバーの角度のついたスロットに配置します。約2マイクロリットルの水、または別のネガティブコントロールをキャピラリーチューブに入れます。解剖したフライを見つけ、10倍空気浸漬明視野対物レンズを使用してラベルに焦点を合わせます。

キャピラリーを10xビューの下のラベルに合わせます。キャピラリー位置をラベルの真正面に残し、ラベルが近づいているが接触していないことを確認します。ステージを動かして、関心のある脳領域を中央に配置します。

40倍対物レンズなどの高倍率の水浸対物レンズに切り替えます。脳の上に約200マイクロリットルのAHLを追加して、液浸対物レンズとの接触を確保します。488ナノメートルのレーザー出力に切り替えて、関心領域のGCaMP発現を特定します。

少なくとも5秒間のベースライン蛍光を収集した後、刺激装置を手動で動かして、毛細血管がラベルを5秒間覆うようにします。刺激を取り除き、必要なだけキャプチャを続けます。次に、AHLを取り外し、10倍明視野に戻って、カバースリップ、刺激装置、およびラベルが正しい位置に留まっていることを確認します。

次に、イメージングチャンバーを取り外し、糸くずの出ないワイプを使用して、キャピラリーから最初の溶液を取り除きます。ピペットを水で洗い流し、次のテイスタントの約2マイクロリットルをキャピラリーチューブにピペットで入れます。Gr64f GCaMPハエの相対的な蛍光変化は、ショ糖刺激の方が水と比較して有意に高く、甘い味覚受容体ニューロンの強力で持続的な応答を示しました。

ショ糖刺激の相対ピーク蛍光は、水の蛍光よりも有意に高かった。Gr66a GCaMPフライの蛍光変化は、水よりもカフェイン刺激の方が有意に高く、カフェインの開始と除去に対する反応を示しました。Gr66aハエの軸索終末の投射パターンはGr64fのそれとは異なり、苦味と糖を感知する味覚受容体ニューロンの解剖学的分離を示しました。