2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

요약

우리는 하나의 살아있는 세포 내에서 subcellular 역학을 측정하는 필터링 가보와 같은 기반으로 한 어두운 현장 현미경 방법을 보여줍니다. 이 기술은 mitochondrial 조각 같은 organelles의 구조 변경에 민감합니다.

초록

우리는 흠없는 살아있는 세포 내에서 organelle의 형태 및 조직에서 발생하는 subcellular 질감을 측정할 수있는 미세한 악기를 보여줍니다. 제안 악기는 organelle의 크기와 모양 nanoscale 변화에 라벨이없는 광학 현미경의 감도를 확장 및 프로그램 세포 사망이나 휴대 전화로 organelle 역학 기본 기본적인 생물 학적 과정에 관한 구조 - 기능 관계의 연구를 가속하는 데 사용할 수 있습니다 차별화. 현미경 쉽게 기존의 현미경 플랫폼에서 구현할 수 있습니다, 따라서 과학자들은 구현하고 접근할 수있는 제안된 방법을 사용할 수 있습니다 각각의 실험실에 전파 수 있습니다.

제안된 기술은 2 차원 광 가보 필터를 통해 세포를 관찰하여 subcellular 구조를 특징 수 있습니다. 이러한 필터는 nanoscale (10의 NM의) 감도가 아닌 구형 subcellular organelles의 크기와 방향에 관한 구체적인 형태학의 특성과 감각을 조정할 수 있습니다. 탄성 산란에 의해 생성되는 반면에 따라 반면, 기술은 morphometric 측정을 추출하는 자세한 역 산란 모델이나 미에 이론에 의존하지 않습니다. 이 기술은 따라서 정확한 이론적으로 흩어 설명 쉽게 부여되지 않은가 아닌 구형 organelles 적용되며, 그들의 기능을 평가하기 위해 흠없는 살아있는 세포 내에서 얻을 수있는 특유의 morphometric 매개 변수를 제공합니다. 기술은 그것이 discretized 개체의 강도보다는 변환 객체의 필드에서 직접 운영되는 디지털 이미지 프로세싱에 비해 유리한 것입니다. 그것은 높은 이미지 샘플링 속도에 의존하지 않기 때문에 따라서 크게 높은 확대 디지털 이미지의 형광 공촛점 현미경 개별 organelle 세분화와 재건축 넘어 organelle 구조의 연구를 촉진, 빠르게 한 번에 세포의 수백 이내 형태학의 활동을 화면으로 사용할 수 있습니다 보기의 제한된 분야.

이 예제에서 우리는 방법론을 설명하기 위해 해양 diatom에서 데이터를 표시합니다. 우리는 또한 메서드가 해당 생물 학적 맥락에서 적용될 수있는 방법에 대한 아이디어를주고 살아있는 세포에서 수집한 예비 데이터를 표시합니다.

프로토콜

1. 세포 준비하기

1. mitochondria의 형광 이미징을위한 Mitotracker 녹색으로 표시해야 전날 도금했다 세포.
2. Mitotracker의 DMSO 녹색으로 4 ° C의 냉동고에서 이전에 만들어진, 그리고 손으로 상온에 따뜻한 100 μm의 주식 솔루션을 제거합니다. 또한 대동맥 내피 세포 보빈 (BAEC) ° C benchtop waterbath에서 37 또한 이전 준비하고 따뜻한 세포 배양 매체를 꺼내.
3. Mitotracker 문화 매체가 따뜻해지되면, 귀하의 장갑 낀 손 및 70 % 에탄올 용액으로 용기의 외부 표면을 소독해야하는 후드에 이들을 배치. 형광 라벨 민감한 빛이고 신속하게 주위 방 조명에 photobleach하므로, 보닛 라이트를 켜지 마십시오.
4. mitochondrial 라벨에 맞는 농도를 만드는 것은 매우 중요합니다. 너무 Mitotracker가 독성 영향을 미칠 수있는 반면 너무 조금, mitochondria 효과적으로 분류하지 않습니다. 세포와 함께 45 분 동안 incubated Mitotracker 100 NM의 농도는 잘 작동합니다. 15 ML 튜브 10 ML 문화 매체 Mitotracker 주식 100 μL를 추가하여이 농도를 준비합니다. 이것은 적어도 하나의 실험들을 사귈 수 있습니다.
5. 진공 라인에 연결된 파스퇴르 피펫으로 오래된 매체를 갉아먹고하여 표시된 매체로 기존의 매체를 교체합니다. 그런 다음 즉시 6 자 접시에 잘 각 점유 문화 레이블 중간 2 ML를 추가합니다.
6. 형광 라벨 빛에 민감한 때문에, 직접 방 불빛에 노출하지 않고 신속하게 배양기에서 세포를 교체하십시오. 손으로 6 잘 접시를 덮고하면이에 대한 잘 작동합니다. 세포는 45 분 동안 인큐베이터에 남아있을 것입니다.

2. 광학 설치 준비하기

1. 세포 배양기에서 기다리는 동안, 우리는 광학 설정에 설정해야합니다. 광학 실에서 먼저 컴퓨터, 현미경, 카메라, 레이저 다음, 수은 아크 램프를 켭니다. 그런 다음 디지털 micromirror 장치 (DMD)와 방적 디퓨저에 꽂습니다.
2. 광학 출시가보기의 필드가 밝은 레이저 조명에 의해 조명 있는지 확인하기 위해 현미경의 접안 렌즈를 통해보고 정렬되었는지 확인하십시오.
3. 꽉 광장으로 렌즈 종이 한 조각을 접는하여 목표를 청소하고 hemostat로 단단히 파악. 종이로 작은 금액을 흡수하기 위해 암모니아없는 유리 청소 용액에 렌즈 종이를 찍어. 랩은 무료로 손으로 여러 번에 hemostat은 초과를 제거합니다. 단단히 중간에 렌즈를 통해가는, 다른 한 끝에서 목적 건너 깨끗하고 지속 슬쩍를 적용하여 목표를 닦아주십시오. 다시 강타하거나 문지르지 마십시오. 사용하는 종이를 폐기하십시오.
4. 샘플을로드하려면, 대상이 내려가있는 동안 목표 이상 침지 오일 1-2 방울을 작은 놓아 63x 기름 침지 목표를 통해 경위 선망을 놓으십시오. 그 다음 단계의 경위 선망을 놓으십시오. 그런 다음 기름은 샘플을 "챙기고"그래서 그 목표를 올립니다. 접안 렌즈에서 샘플을 집중.
5. 콘덴서를 정렬하려면, 그것이 콘덴서 분야 정류장의 육각형 가장자리를 집중하여 중앙 콜러 조명으로 정렬되도록 콘덴서의 높이를 조정합니다. 센터 콘덴서 필드는 콘덴서를 중심으로 손잡이를 돌려하여 필요한 경우보기의 필드를 통해 중지합니다. 응축기 조리개 정지 폐쇄해야합니다.
6. RoperScientific 캐스케이드 512 카메라를 작동 IPlab 프로그램 및 입력 설정을 시작합니다. 카메라 전송 모드를 프레임으로 설정되었는지 확인합니다. "초점을 취득"명령을 실행하여 라이브 미리보기를 시작합니다. 색인 접두사와 파일 위치 이미지가 저장되는로 설정합니다.
7. CoolSnap 프로그램을 운영 RSImage 프로그램과 입력 설정을 시작합니다. 클러킹 모드가 정상으로 설정해야합니다.
8. DMD 소프트웨어를 시작하고 다음 스크립트 메뉴에서 암시야 홍채, 장소 "로드하고 초기화"명령과 스크립트를 실행합니다.
9. LSM에 현미경 optovar 및 뷰포트 설정하여 DMD와 캐스케이드 512 카메라에 빛을 보내십시오. 이것은 CCD에 DF 이미지를 예상, DMD 및 정렬 광학을 통해 이미지를 전송합니다. 암시야 (DF) 이미지 IPlab 이미 진행 라이브 미리보기에 나타납니다. 필요한 라이브 미리보기 이미지를 집중할 경우 현미경의 미세 초점을 조정합니다.
10. "단일 획득"명령을 사용하여 볼 분야의 스냅샷을 가져가라. 이미지 신호의 적어도 만 카운트를 보장하기 위해 충분히 높은 노출 시간을 설정합니다. 취득 후, 디스크에 이미지를 저장하기 위해 "으로 색인 저장"명령을 사용합니다. 경위 선망의이 이미지는보기 (FOV)의 필드의 크기를 측정합니다.
11. 자, 단 배경이 표시되도록 경위 선망의 FOV 넘어 있도록 경위 선망 샘플을 이동합니다. 에있는 필드의 배경 이미지를 취득신호의 최소 5,000 건의가 들어오는 것을 보장하기 위해 오래 노출 시간. 이 이미지는 필터없는 이미지 배경 제거에 도움이됩니다.

3. filterbank를로드하고 필터링 - 배경 이미지를 얻기위한 설정을 사용하여

1. 이제 우리는 배경의 가보 필터링 이미지를 획득해야합니다. DMD 제어 소프트웨어에 가보 필터 뱅크 스크립트를로드합니다. DMD의 온보드 메모리에 필터를 버퍼에 전체 스크립트를 실행, 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
2. 전체 스크립트가 버퍼되면, 우리는 이제 배경 필터링된 이미지를 수집할 수 있습니다. 시작을 사용하여 한 번에 한 가보와 같은 필터에 해당하는 필터의 한 세트를로드하는 DMD 지시하는 DMD 소프트웨어 내의 마커를 중지하고, 스크립트를 실행합니다. 라이브 이미지 미리보기는 필터의 필터링 이미지에 어두운 현장에서 변경해야합니다.
3. 디스크에서 IPlab의 수집 스크립트를 엽니다. 신호의 적어도 2000 카운트가 인수되는 것을 보장하기 위해 노출 시간을 조정합니다. DMD 스크립트가 실행으로 IPlab의 라이브 미리보기를 취소하고 수집 스크립트를 실행합니다. 이것은 자동으로 획득, 색인 생성 및 디스크에 필터링된 이미지를 저장합니다.
4. 첫 번째 이미지가 인수되면, DMD 소프트웨어에서 실행중인 스크립트를 중지하고 스크립트에서 사용하는 명령을 삭제합니다. 다음 필터 설정의 시작과 끝에 시작 및 중지 마커를 교체합니다. IPlab의 인수를 반복합니다.
5. 전체 filterbank 사용되었고 필터링된 모든 이미지는 취득 및 저장 때까지 단계 3.4를 반복합니다.

4. 세포를 도금

1. 지금까지는 세포는 곧 실험을 위해 접시에 준비합니다. 실험실 benchtop에 납땜 인두에 꽂습니다. 37 ° C.에 L15보기 매체와 열을 제거 종이 타월과 Kimwipe와 워크 스테이션을 만듭니다. Kimwipes을 이간하고 휘두르네하여 여러 빅스하십시오. 빅스는하고 셀 플레이트에서 액체를 전송에 도움이 될 것입니다.
2. 이 후, 우리는 접시 샘플을해야합니다. 우리는 사이에 금속 플레이트와 "coverslip 샌드위치"를 만드는 접시의 세포를 가공 금속 샘플 홀더를 사용합니다. 양쪽에있는 홈의 끝을 대한 중간 확장 금속 플레이트 구멍의 위쪽 주변 주사기에서 진공 그리스의 얇은 구슬을 적용합니다. 부드럽게 깨끗한 없음을 누르십시오. 그리스에 한 coverslip. 접시를 뒤집어하고 구멍 주위에 그리스를 적용합니다. 객실 조명을 끄십시오.
3. 이제 우리는 70 % 에탄올로 소독 nitrile 시험 장갑과 보육의 내용을 취급, 배양기에서 세포를 얻을. 인큐베이터의 문이 열려있는 동안 숨을 잡고 인큐베이터에서 셀 플레이트를 제거합니다. 객실 조명에 노출을 최소화하기 위해주의하십시오.
4. 우물에 얼굴까지 있었던 측면이 세포가 붙어있는 측면이라고 지적 6 잘 판에서 실험에 사용됩니다 coverslip을 제거합니다. coverslip의 측면은 세포를 가지고 추적하는 유지하면서 그것이 거의 완전히 건조 될 때까지 조심스럽게 양쪽 coverslip을 건조. 그런 다음에는 공기 간격은 기름 층 내에 남아 있는지 확인하고, 보는 구멍을 통해 기름칠 금속 접시로, 아래로 coverslip, 휴대 측면을 누르십시오. 기름은 우리가 L15 매체와 세포를 읽어 들일 수 있도록 방수 도장을 형성해야합니다. 일단 당신이 특정 있으며,을 통해 다시 접시를 플립.
5. 상단 coverslip와 금속판 사이의 홈을 통해 액체를 강제로 도금 세포에 L15 매체를 피펫. 한 번에 200 μL를 Pipetting하면 잘 작동합니다. 첫 번째 볼륨 피펫 거의 반대편에있는 홈에 걸쳐 액체로 coverslips 사이에 끼워 넣으면 공간을 채우기해야합니다.
6. 도금 세포에 매체의 또 다른 200 μL를 피펫지만, 이번은 매체가 한쪽에서 다른 흐름 있도록 반대 숲에서 심지를 개최. 이것은 세포를 세척하고 기존 매체의 모든 흔적을 제거합니다. 이 단계 동안 액체 내에서 형성에서 모든 거품을 방지하기 위해주의하십시오. 이 과정을 각 린스에 대한 새 심지를 사용하여 2-3 번 반복합니다.
7. 우리가 꽂혀 납땜 인두를 기억해? 이제 사용 도착 시간입니다. 그 액체가 세포 저수지에 갇혀 아래로 똑 수 있도록 가장자리에서 번호판을 지원, 한번 더 뒤집어 접시를 플립. valap의 비커에 납땜 인두를 찍어. 이것은 신속하게 다음 납땜 인두 팁 살아가는 것입니다 valap의 일부를 녹여 것입니다. 조심스럽게 작은 주걱으로 납땜 인두 팁을 사용하여 바닥 coverslip (이 지금은 위를 향하고있다)의 가장자리 주위에 녹은 valap를 적용합니다. 금속 접시에 coverslip을 밀폐, coverslip의 주위에있는 모든 방법을 수영하고 당신이 갈 때까지 계속 적용.
8. 아래 coverslip은 세포가 그것에 성장하고 있으며, 노출된 면에 건조까지 미디어의 잔류물이있을 수 있습니다. Kimwipe과 cleanin를 버릇하여 coverslip 표면에서 어떤 잔류물을 청소g 많은 목표를 청소처럼 하나의 미끄럼 운동에 coverslip. 이것은 coverslip가가 볼 수 중심부에 깨끗한 것을 보장합니다.
9. 납땜 인두를 분리하고 같은 억압과 불임의 절차를 관찰 인큐베이터에 6 자 번호판을 반환합니다. 로 단계 2.4 및 2.5에 명시된 목적에 광학 실험실과 마운트 도금 세포를 가져가라.

5. 실험을 실시

1. 건강 보이는 세포의 멋진 필드를 찾으십시오.
2. 보기의 필드 암시야 이미지를 수집. 미분 간섭 대비 (DIC)에 현미경을 정렬하고 DIC 이미지를 획득. 노출 시간 그 신호가 적절한한지 오래되었는지 확인합니다.
3. 이제 우리는 다른 카메라에 형광 이미지를 획득해야합니다. CoolSnap에 DIC 이미지를 얻으려면, 우리는 파란색이 그것을 교체하고 필요에 따라 그것을 제거 콘덴서에 연결된 LED를 사용하십시오. 현미경 여전히 DIC으로 정렬하는 동안 100 %의 쌍안경에 1.0x와 뷰포트에 현미경 optovar을 설정하여 CoolSnap에 빛을 보내십시오. 접안 렌즈에서 카메라로 이미지를 돌리세요. 장소 필드를 조명하고 RSimage의 FOV를 미리하고 필요한 경우 미세 초점을 조정하기 위해 콘덴서를 통해 LED. DIC 이미지를 수집하고 디스크에 저장합니다. FOV는 캐스케이드 카메라에서 얻은 것과 다른 방법을합니다. 이 이미지는 실험 후 분석 단계에서 등록해야합니다.
4. 플루오레신 filtercube에 필터 큐브를 조정하여 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. 간단히 현미경을 사용하여 형광 여기에 설정하여 이미지를 수집하고 인수가 완료되면 다음 즉시 전원을 끕니다. 우리가 DIC의 샘플을 집중 때문에, 형광 이미지뿐만 아니라 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 따라서 photobleaching 느려지고, 형광의 노출 시간을 절약할 수 있습니다. 디스크에 형광 이미지를 저장합니다.
5. 이제 우리는 필터링된 이미지를 획득해야합니다. 어둠의 필드에 현미경을 재설정하고 2.9에서와 LSM 포트를 통해 빛을 다시 보내십시오.
6. 3.3-3.5에서와 같이 전체 가보의 filterbank 스크립트를 실행합니다. 우리는 지금 한 시점에 대한 데이터 수집을 완료했습니다.

6. staurosporine (STS)에 세포를 노출하기 위해 매체를 전환하고, 실험을하는 동안 미디어를 유지

1. 세포는 여전히 무대에서 볼 분야를 방해하지 않고 있지만, DMSO에서 STS의 4 MM 주식 솔루션 만든 STS의 1 μm의 솔루션을 포함 동일한 위해 정규 L - 15 중간을 전환합니다. 미디어를 전환하는 단계 4.6에 설명된 위킹 메서드를 사용합니다.
2. 이제, 우리는 후속 시간 지점 5.2-5.6 단계를 반복합니다. 실험이 완료될 때까지이 과정을 반복합니다.
3. 실험의 과정에서 더 많은 매체는 샘플 마르다하지 않도록 추가해야합니다. 이것은 무대에서 제거하지 않고와 FOV를 방해하지 않고 셀 플레이트의 과수원에 매체를 pipetting하여 수행됩니다.

7. 대표 결과

실험의 결론에서 수집된 데이터는 subcellular 구조 데이터를 추출하는 처리해야 필터링된 이미지의 다수가 포함됩니다. 두 예제는 필터 기간 S = 0.95μm, 가우스 봉투 표준 편차 S = S / 2 = 0.45μm, 그리고 방향 Φ = 0 ° ~ Φ = 160 ° 20 9 가보 같은 필터로 구성된 광학 필터 뱅크에 대한 표시됩니다 ° 증가. ([1] 자세한 내용을 또한 참조).

예제 1 : 마린 Diatom

우리가 먼저 짙은 필드 (DF) 영상 (그림 1)에서 분명히 볼 수 있었다 지향 기능을 가진 해양 diatom 샘플 (카롤 생물 공급 회사) 우리의 방향 민감한 필터 뱅크를 적용한. 광학 필터 이미지는 비교를위한 샘플의 필터없는 이미지와 함께 표시됩니다.

그림 1 : 암시야 (DF) 및 해양 규조류는의 광학 필터 이미지. 우리는 이미지 (왼쪽 대부분의 패널에 흰색 화살표)의 오른쪽 하단에있는 diatom을 분석합니다.

diatom 아홉 가보 필터링 이미지의 집합은 객체 지향적 및 진원도에 대해 픽셀로 픽셀 처리되었습니다. 처리 (1)함으로써 응답 중요성을 인코딩 신호 응답의 전체 크기를 결정하기 위해 각 픽셀에 전부 9 가보 필터링 이미지 측정된 응답을 합산하고, (2) 가보 필터 방향을 찾기로 구성되어, Φ, 어떤에 응답은 최대화함으로써 각 픽셀에 개체가 선호하는 방향을 가지고 범위를 인코딩 모든 각도에 대한 평균 응답이 최대한 응답의 비율을 복용. 오리 엔테이션의 정도가 밀접하게 입자의 기하학적 비율에 관련되어 있습니다. 그림. 2B, 일필터 뱅크 (매개 변수 1) 방향 또는 가로 세로 비율 (매개 변수 2) 정도로 픽셀의 전자 전체 응답이 각각의 색상 채도 및 색조로 인코딩됩니다. 큰 값 (적색)가 높은 선호하는 각도 응답이 존재하는 영역을 표시하면서 니어 1 비율 (파란색)은 더 선호하는 응답 각도가 없습니다하는 분야에 속해 있습니다. 지하 입자의 방향은 각 라인이 밀접하게 필터없는 어두운 분야 (그림 2A)에서 볼 수 기본 로컬 객체 지향적 동의 퀴버 줄거리 (그림 2C)로 인코딩됩니다.

그림 2 : A : diatom의 암시야 이미지. B : 객체 지향적 이미지. 밝기는 총 가보 필터 응답의 중요성을 인코딩하면서 색상 규모는 방향의 정도 (비율)을 나타냅니다. C : 응답 강도 ≥ 최대 10 % 개체의 오리 엔테이션. 선 세그먼트는 해당 구조의 긴 축을 나타냅니다.

예제 2 : Apoptotic 세포

여기서 우리는 diatom 같은 방식으로 처리했다 staurosporine (STS)로 처리 소 내피 세포의 필터링된 이미지를 보여줍니다. 그림. 3 시간 T에 아홉 필터링된 이미지 =- 180 분과 함께 세포의 필터없는 어두운 필드 (DF) 이미지를 보여줍니다. STS 처리하기 전에.

그림 3 : 여러 가지 살아있는 내피 세포를 포함하는 암시야 (DF) 및 광학 필터 필드의 이미지.

필터링된 이미지는 이후 STS 처리 후 3 시간 동안 20 분 간격을 인수했다. 그림. 4A 시간의 함수로 세포의 비율의지도를 보여줍니다. 이 경우에는 컬러 색상은 그림의 색상 색조에 대해서는 오리 엔테이션의 정도 (레이블 orientedness)를 나타냅니다. 위의 2B. 그러나, 비율의 밝기는 평균 필터 응답에 의해 가중치되지 않았습니다. (그림 4B)이 세포에있는 레이블 mitochondria의 형광 이미지의 비율지도을 등록하여, 우리는 측정된 비율 드롭이 mitochondria가 들어있는 세포 지역에 한정된 것을 결정하고 직접 관측할 수 있었을 mitochondrial 조각과 함께 수반하는습니다 같은 세포의 형광 이미지. 그림. 5 apoptosis를 겪고 세포 시간의 함수로 화면 비율의 변화를 묘사하는 시간 플롯을 보여줍니다. 각각의 세포 내에서 T의 화면 비율의 하락에있다 = 60-100 형광 mitochondria에 등록 지역 분,하지만 희미한 배경 형광 영역에 등록 지역 인치

그림 4 : 화면 비율 (A) 및 형광 (B) apoptosis의 유도, staurosporine 취급 내피 세포의 이미지.

그림 5 : staurosporine 취급 내피 세포 입자 비율 (orientedness)의 감소를 비교 시간 플롯. 개별 흔적은 하나의 세포 내에서 시간 플롯을 나타냅니다. orientedness의 드롭은 형광 mitochondria (왼쪽 패널)에 등록 세포의 영역에 국한하고 나머지 배경 형광 지역 (오른쪽 패널)에서 결석입니다.

지금 우리가 비율 하락은 mitochondrial 조각에 해당하는 것으로 판단했는지, 우리는 이들 세포의 apoptosis를 유도 세포 레이블을하지 않고 우리의 광 산란 방법을 사용하여 조각을 측정하고, 이것에 다른 유전자와 실험 조건의 효과를 공부 다이나믹.

토론

방법은 예를 들어, 입자 크기 또는 방향을 인코딩 수있는 개체의 수율 morphometric지도 위에서 설명한. 이 구조 정보는 여러 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 :

1. 이것은 특정 치료 중에 변경된 후 추가로 특정 분자와 생화 학적 assays와 함께이 지역을 분석 아르 조직 또는 셀 영역을 식별하는 초기 화면으로 사용할 수 있습니다.
2. 그것은 subcellular 구조 (이 방법에 의해)의 양적 특성과 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen		Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium	Invitrogen		Without phenol red
L-glutamine	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Bovine Brain Extract	Clonetics
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products
Heparin	Sigma-Aldrich
Staurosporine	Sigma-Aldrich
Dymethylsulfoxide	Sigma-Aldrich
Inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	High (16 bit) dynamic range CCD
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf