급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

요약

우리는 이일 이후 fetilization (DPF) 급성 신장 손상 (아키)를 유도하기 위해 zebrafish의 유충에 aminoglycoside, gentamicin을 microinjecting의 기술을 설명합니다. 우리는 또한 전체 탑재 immunohistochemistry하는 방법을 설명, 플라스틱 포함하고 아키 인한 손상을 시각화하기 위해 zebrafish 애벌레의 sectioning.

초록

이 비디오를 문서에서 우리는 nephrotoxicant로 gentamicin을 사용하여 아키의 zebrafish 모델을 설명합니다. 이 기술은 2 DPF의 zebrafish에있는 정맥 microinjections로 구성되어 있습니다. 이 기술은 시간당 15-20 물고기의 주입을 허용, zebrafish 애벌레의 혈류로 수용성 물질을 제공하는 효율적이고 빠른 방법을 나타냅니다. 아키 연구 이외에,이 microinjection 기술은 또한 혈관 조영술과 같은 실험 연구의 다른 유형에 사용할 수 있습니다. 우리는 감소 신장 기능의 시각 대책에 필요한 설비의 기술에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 또한 신장 가느다란 관 마커, 플라스틱 포함하고 애벌레 zebrafish의 sectioning로 고정, 전체 탑재 immunohistochemistry의 과정을 보여줍니다. 부종, 근위 관 상피 세포에서 세포 극성의 손실, 그리고 가느다란 관의 형태학의 장애 : 우리는 gentamicin와 함께 주입 zebrafish의 애벌레가 일관성이 아키와 형태학의 기능을 보여 보여줍니다.

프로토콜

다음과 같은 프로토콜의 일부로 (Hentschel 외. 2005 년)과 (웨인 스테인 외. 1995) 약간의 수정을보고 게시 방법에 따라 달라집니다.

1 부 : Microinjections

microinjection을 위해 사전에 설정

• 물고기는 이일 후 수정 (DPF)에 주입하고 있습니다. 따라서, 성인 zebrafish는 계획된 실험을하기 전에 3 박 자란 있습니다. 배아를 수집하고 28.5에서 E3 물 (5mM NaCl, KCL 0.17mM, 0.33mM CaCl _2, 0.33mM MgSO ₄₎ 페트리 접시에 넣어 ° C. 페트리 접시 당 80-100 배아가되도록 첫날의 끝에 페트리 접시와 별도의 배아에서 죽은 태아를 제거합니다.
• 전극 풀러와 모세관 튜브 (길이, 0.63 / 0.20 OD / ID 밀리미터 (㎜) R - 6 사용자 정의 유리 튜브 드루먼드 과학 회사, Broomall, PA 9-000-3000 4 인치)에서 당기 유리 바늘을 준비합니다. 팁 직경 10-20 μm의해야한다. 해부 현미경 (Leica S6E), 영구 마커와 통치자의 도움으로, 바늘을 따라 약 10 1mm 라인을 그리기, 그리고 점토 경사로에 큰 페트리 접시에 바늘을 저장합니다.
• 의 내부 직경까지 알콜 램프의 불꽃에 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 유리 모세관 (152mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100 - 6, 세계 정밀 계측기, 주식 회사)의 화재 - 폴란드어 팁 : 들고 피펫 준비 팁은 0.4-0.5 mm이다. 이러한 차원은 2 DPF의 zebrafish의 애벌레의 난황을 잘 파악을 허용합니다. , 유리 조각 긴 집게를 사용하여 모세관과 알콜 램프와 모세관의 반대로 팁을 가열, 1-2 초 동안 불꽃의 하늘색 안쪽 원추, 가장 인기있는 부분을 통해 수직으로 그것을 배치의 한쪽 끝을 잡고 도 녹기 얻기 위해 그것을 압연. 무대 마이크로 미터 (워드 94 W 9910)에서, 몇 번 그런 다음 현미경으로 모세관을 검토이 과정을 반복합니다. 당신이 유충을 처리하는 동안 이것은 중요한 단계는, 몇 지주 pipettes를 해고 - 폴란드어 나중에 적절한 크기를 선택하는 데 필요한 수 있습니다. 당신이주의하는 경우, 하나 들고 피펫 여러 microinjection 세션 지속.
• 제조 업체에서 제공된 지침에 따라 광유와 수동 Microsyringe 펌프 (MMP, 세계 정밀 계측기, 주식 회사), 작성하십시오. 피펫 홀더는 철판 (Narishige, IP)에 자석 스탠드 (Narishige, MN 151)와 연결된 조이스틱 조작하는 사람 (Narishige, MN - 151)에 삽입됩니다.

Microinjection

• 사출 혼합물의 20μl 준비 :. 2.4μl gentamicin (생리 식염수에 시그마 - 알드리치 G8648, 50mg/ml)와 17.6μl 10 KDA 루시퍼 노란색 dextran (Invitrogen D1825을 (생리 식염수에 1mg/ml) 제어 생선에서 gentamicin은 생리 식염수로 대체됩니다. 형광 dextran (여러 색상 사용될 수)가 분사의 정확성을 확인하고 nephrotoxicant로 주입되었을 애벌레를 선택하는 충분하다.
• 솔루션의 증발을 방지하기 위해, 아래에있는 분사 혼합 및 제어 혼합 배치에 대한 2ml 광유 2 30mm 페트리 요리를 준비합니다.
• 400 밀리그램 tricaine 분말 (에틸 - m - aminobenzoate methanesulfonate 시그마 A - 5040) 97.7 ML DD 물, 2.1 ML 1M 트리스 (산도 9) : 마취를 준비합니다. 산도 7 조정할 수 있습니다. 4.2 ML의 aliquots에 냉동실에이 주식 솔루션을 저장합니다. 마취 100 ML의 E3 물 (웨스 1993)에서 4.2 ML tricaine 주식 솔루션을 희석하여 실온에서 떠나 tricaine를 사용할 수 있습니다.

다음 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다

• 수동으로 미세 집게로 남아있는 모든 chorions를 제거하고 tricaine있는 페트리 접시에서 그들을 전송 zebrafish는 실온에서 예열 마취. Zebrafish는 적어도 15 분 microinjections를 시작하기 전에 tricaine에 노출되어야합니다.
• 면도날 (VWR 과학 55411-050)를 사용하여 주입 바늘의 끝부분을 엽니다. 베벨을 만들고 약 10 - 20μm 직경의 팁 오프닝을 얻기 위해 같은 팁을 잘라 약간 각도에서 칼날을 잡고.
• 전원, 진공 및 microinjection 장치 (세계 정밀 계기 주식 회사, PV820 공압 picopump)의 공기 공급을 켜십시오. micromanipulator 및 틸팅 자료 (워드 정밀 계측기, 주식 회사, 모델 M3301R, TB - 1)에 장착된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다.
• 바늘을 채우기 위해, 미네랄 오일 (피셔 화학 물질, 0121-1)로 가득 30mm 페트리 접시에 주입하는 솔루션의 비말 (10μl)를 놓으십시오. , 잠수함 솔루션의 드롭 바늘의 팁을을 줄 수있는만큼 매뉴얼 micromanipulator 돌려 picopump을 설정 ( "환기"PV820에 진공을 equates) "환기"로 전환하고, 당겨 바늘을 채우기 "환기 / 개최" 바늘 끝 통해 솔루션입니다. 솔루션을 너무 빨리 바늘에 합격하면 이것은, 몇 분 정도 걸릴 것입니다그것은 팁의 직경이 너무 큰 것을 의미하고, 주사가 정확하지 않습니다. 바늘이 채워진 후 ( "대기"는 PV820에 삽입하는 equates) "대기"로 picopump가 설정할 수 있습니다.
• 바늘을 보정하려면, "문이"마킹 하나에서 다음 (1 여행 초승달 모양 것이 걸리는 시간 (초)을 바늘을 배출하기 위해 발 페달을 눌러 기록 picopump "게이 티드 / 시간이 초과되었습니다"스위치를 설정 mm 총 거리). 3 회 반복 평균 시간 (초)을 받아, 및 솔루션 1 NL을 제공하는 데 필요한 시간 (밀리초)의 수를 결정하기 위해 30 일 (1mm 선형 거리에 해당하는 nanoliters의 볼륨 (NL))의 가치를 나눕니다. 이 번호로 범위 기간 노브를 조정하고, '초과'로 "시간 초과 / 게이 티드"스위치를 이동합니다. 이제 picopump는 솔루션의 1nl 펄스를 제공하기 위해 설정됩니다.
• 미네랄 오일 요리와 위치 현미경으로 애벌레와 페트리 접시를 제거합니다. 그룹 페트리 접시와 초점의 중심에있는 물고기.
• 페트리 접시하기 위해 팁을을 향상시키고 현미경의 초점 비행기로, microinjector의 반대편에있는 매뉴얼 microsyringe 펌프에서 개최 피펫 (MMP, 세계 정밀 기기) 장소. 개최 피펫의 가장 끝은 페트리 접시의 바닥을 감동과 수평에 가까운이다 있도록 비교적 얕은 각도로 구부 러. 응답 시간을 느리게하고 MMP의 정밀도를 감소하는 것이, 시스템에 공기 방울을하지 않도록하십시오.
• 현미경을 높은 배율로 변경하여 개최 피펫 매우 가까운 노른자와 애벌레 생선 등의 측면을 위치로 처리 (테드 펠라 113)와 극상의의 속눈썹을 사용합니다. 수동 microsyringe 펌프를 제어하는​​ 마이크로 드라이브를 반시계 방향 회전으로 ​​잡고 피펫에 노른자를 빠는하여 애벌레 물고기를 잡아. 보관 피펫에 너무 깊이 가져온 경우에는 노른자가 버스트 수있는, 너무 멀리 마이크로 미터를 돌려 안됩니다. 노른자를 통해, 그냥 periderm 아래 위치해 있으며, 매우 높은 혈액 흐름의 사이트입니다 형성 일반 추기경 정맥에 중점을두고 있습니다. 사출 장치의 micromanipulator으로 개발 일반 추기경 정맥에 바늘을 안내입니다. 일반 추기경 정맥은 매우 피상적​​이므로 그것은 일반적으로 삽입 후 다시 조금 바늘을 뽑아 필요합니다. 발 페달을 눌러 솔루션의 1nl를 삽입 후 보관 피펫의 유충을 해제하고 배아 물로 돌아갑니다. 그것은 물고기를 위치하고 흡입 및 장비의 압력을 조절하는 연습의 일정 금액을 필요로하기 때문에, 특히 중요한 단계, 첫 번째 시간입니다. 배아의 노른자가 제대로 잡고 피펫과 함께 개최되는 경우 바늘이 들어오면 그걸로 롤되지 않습니다.
• microinjection의 성공을 확인하려면, 형광 현미경 zebrafish의 중심부에 루시퍼 노란색 dextran의 존재를 모니터링합니다. nephrotoxic 솔루션은 거의 루시퍼 노란색 dextran은 주사의 사이트에 남아 볼 수 사출 2 시간 이내에 정확하게 주입하는 경우 루시퍼의 노란색은 순환 시스템에 dissipating 전에 약 20 분 동안의 심장에 표시 남아 있습니다. 솔루션 난황으로서, 루시퍼 노란색 dextran의 자리에 주입하는 경우 주사의 사이트에 남아있게됩니다. (그림 1). E3 중간에 물고기를 반환합니다.
• 이틀 후 주사, 애벌레 감소 신장 기능의 결과 (그림 2) pericardial 부종을 개발합니다.

2 부 : NA로 고정하고 immunofluorescence ⁺ / K ⁺ ATPase 항체 (α - 6F)

• 4 DPF에서 10 4ml 유리 튜브에서 15 애벌레 zebrafish (Weathon, 225,012) 사이에 넣고 1ml 덴트의 (80% MeOH 20% DMSO) RT 4 시간에서 그들을 채운다.
• 솔루션을 pipetting하고 (같은 유리병에 새로운 솔루션을 추가, 등급 MeOH / PBT (0.5 % Tween20와 PBS) 시리즈, 75:25 50:50, 25:75, 100 % PBT에서 배아를 Rehydrate 당 솔루션 1ml 유리병), 각 용액에 20 분. 애벌레가 공기에 노출되지 않을 것입니다, 솔루션을 변경할 때 애벌레를 덮고 조금 솔루션을 두십시오.
• PBT를 제거하고 ° C nutator 4에서 3 시간 동안 차단 솔루션 (PBS 1퍼센트 DMSO와 0.5 % Tween20 10 % 정상 염소 혈청)에 1ml 대체합니다.
• 2ml microfuge에 애벌레를 전송합니다. 혈청 차단 제거하고 nutator 4 ° C에서 하룻밤 (PBS로 1퍼센트 DMSO, 0.5 % Tween20, 2% 정상 염소 혈청) 배양 용액에 300μl 일차 항체로 바꿉니다. 우리는 1시 25분 희석에서 단클론 나 ⁺ / K ⁺ ATPase의 항체를 (α - 6F, 뜨는, 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와)을 사용
• 기본 항체를 제거하고 RT에서 부화 솔루션 3 X 30 분 씻으십시오.
• 이차 항체 (염소 안티 - 마우스 cy3, 잭슨 Immunoresearch 연구소 (주) 155-165-003)로 품어은 2 시간에 대한 배양 용액에 1:500 희석RT.
• PBT 3 X 30 분 씻으십시오.

파트 3 : JB - 4 플라스틱 삽입

• 단계마다 10 분 등급 에탄올 시리즈 (; 75%,, 95% 백퍼센트 X 2 50 %)을 통해 조직을 탈수.
• JB - 4 임베딩 솔루션 25 ML (Polysciences 0226A)와 촉매 0.24g (Polysciences 02618) : 침투 솔루션을 준비합니다. 촉매가 20-30분 약 분해하는 것은 잠시 걸립니다. 솔루션은 4 저장할 수 있습니다 ° C 최대 1 개월.
• 100 % 에탄올을 가만히 따르다 및 플라스틱 침투 솔루션으로 대체합니다. 회전에 유리병에게 4 ° C를 삽입하고 침투가 유리관의 하단에 애벌레 싱크까지 진행할 수 있습니다. 이 과정은 일반적으로 약 30 분이 소요됩니다.
• 해부 현미경 플레이스 플라스틱 성형 컵 트레이 (Polysciences 주식 회사 16643A) : 프로토콜을 포함. 컵에 충당하기 위해 침투 솔루션과 함께 애벌레를 전송합니다. 플라스틱 퍼가기 미디어는 작은 플라스틱 튜브에 준비가되어 있습니다. 우리는 일반적으로, 한 번에 각각의 컵 하나의 물고기를 4-5 물고기를 포함. 침투 솔루션의 각 ML에 대한 JB - 4 임베딩 솔루션 "B"35 μl (Polysciences 주식 0226B)를 추가 퍼가기 플라스틱 5-6 ML (각 컵에 대한 솔루션을 포함 1.2 ML)를 준비합니다. 침투 솔루션의 각 ML에 대한 JB - 4 임베딩 솔루션 "B"(Polysciences 주식 0226B) 35 μl를 추가합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫 여러 시대와 위아래로 pipetting, 잘 섞는다. 혼합되지 않을 경우 잘 JB - 4가 제대로 중합되지 않으므로이 중요합니다. 퍼가기 플라스틱의 5ml가 준비되고 나면, 파스퇴르 피펫과 샘플 각국의 침투 플라스틱을 제거합니다. 플라스틱을 삽입와 함께 잔을 채우십시오. 플라스틱은 표본으로 블록 홀더 잘 첨부 파일을 위해, 컵 밖으로 스며 나오게하다해야합니다. zebrafish 신장의 tubules를 감지하기 위해 가로 부분은 최고입니다. 이러한 목적으로, 물고기가 수직 포함되며, 아래로 향합니다. 플라스틱 그들이 자신의 위치에서 이동하지 않는 것이 힘든 정도가 될 때까지 처리 또는 미세 집게로 속눈썹의 도움과 함께 정기적으로, 수직으로 물고기를 위치. 그것은 약 20-30분 걸립니다. 그런 다음, 컵을 통해 EBH - 2 블록 홀더 (Polysciences 주식 15,899)을 넣고 ° C 야간 4 트레이를 두십시오. 완료되면에서 중합, 당신은 얼음 조각처럼 블록 튀어나와 있습니다.
• 여러 애벌레의 대체 퍼가기 프로토콜 : 중간 완료 JB - 4와 금형을 기입하고 그것이 중합 수 있습니다. 15mm 정사각형 금형을 위해 우리는 중간 금형을 채울 700μl의 JB - 4 볼륨을 사용합니다. 다음 사전 polymerized 반 채워진 금형에 경화제와 JB - 4 절어 애벌레를 추가합니다. 동양 머리가​​ 금형의 긴 쪽 방향으로 지목하고 애벌레를 정렬과 애벌레 눈알 라인 접속 (당신이 라인에 하나의 몰드 10 물고기를 넣을 수 있습니다) 그럼. 블록 polymerized 후 당신은 블록 가장자리를 잘라 수있는 측면이 칼을 마주되게 시스템을 켜고 마이크로톰에 맞는 플라스틱 "척"에 superglue. 이 방법을 사용하면 같은 플라스틱의 중심 블록, 그리고 크로스 섹션에 대한 준비에 애벌레의 큰 숫자를 배치할 수 있습니다. 케어는 각 물고기의 상당 부분이 하나의 섹션에서 찍은되도록 칼로 블록을 orienting주의가 필요하다. 눈을 통해 sectioning 동안이 수행할 수 있습니다 : 즉, 방향 블록은 눈 상당 부분 각 생선을 찍은 수 있도록. 최종 결과는 하나의 현미경 슬라이드에 concomitantly 많은 물고기를 분석할 수있다.

4 부 : Sectioning

• 마이크로톰의 척 홀더 (우리가 쉔던 피니스 써모 전기 공사 마이크로톰 사용)로 표본을 설정
• 45 따뜻한 슬라이드를 설정 ° C.
• 비이커에 DI의 물을 붓고하고 마이크로톰 가까운 곳
• sectioning 전에 블록이 물고기의 완벽한 가로 섹션을 얻기 위해 같은 방향으로되어 있는지 확인합니다. 방향 헤드 조절 레버는 칼을에 정확하게 표본 헤드를 위치로 사용 회전 수 있습니다. 물고기의 머리를 통해 두꺼운 부분을 절단 시작합니다. 눈을 통해 sectioning 있지만, 방향 블록 것은 눈의 상당 부분은 각 생선을 찍은 수 있도록. pronephric tubules가 시작할 때 가슴 지느러미는 부분에 표시하면, 그입니다. 이 시점에서, 블록에서 32 사 음 섹션에 대한 했네요.
• 포셉로 섹션을 수집하고 포셉로 물을 대지 않고, 그들이 물을 비커에 떨어뜨려. 그것은 물의 표면을 명중 같은 섹션은 즉시 확장되며, 지금은 슬라이드에 수집할 수 있습니다. 45 ° 각도로 물에 슬라이드를 삽입하고 부분만을 경계를 만지고, 처리와 속눈썹의 도움으로 섹션을 접근한다.
• 완전히 건조까지 따뜻한 슬라이드에 슬라이드를 품어.
• epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 섹션.

제 5 부 : 대표 레스ults

제대로 수행하면, 주입된 물고기는 작은 형광 dextran 심장과 순환기 시스템에 표시 (루시퍼 노란색이 경우에는)으로, 그림 1처럼 나타납니다. 주사가 너무 깊은 경우, 주입 물질은 난황에 집중적으로 볼 수있다, 또는 마음 과도한 출혈을 일으키는 구멍 수 있습니다. 지주 피펫가 올바르게 만들어진 경우, 물고기 롤되지 않습니다 또는 주입했을 때 이동이 좀 더 정확하게 주사를하실 수 있습니다. 또한, 응답 시간을 느리게하고 시스템의 정밀도를 감소하는 것이, MMP에 공기 방울을 가지고 있지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 일반적으로, gentamicin의 nephrotoxicity의 결과로 주입 물고기의 80 %가 pericardial 부종 (그림 2) 개발. 우리는 분명 pericardial 부종을 보여주지만, 심각하게 부종이 발생 물고기가 축 곡률을 검토하기 위해 약간과 pericardial 및 트렁크 부종을 보여주 반면 전혀 다른, phenotypes을 관찰할 수없는 적당한 부종과 함께하는 물고기의 표현형 기반 분류 시스템을 사용합니다. 나에 대한 신장 가느다란 관 항체를 사용하여 ⁺ / K ⁺ ATPase는 (α - 6F) 우리가 컨트롤 (그림 3)에 비해 손상 tubules에서 세포 극성과 관형 중단의 분명 손실, 가로 섹션에 손상된 tubules를 시각화 수 있습니다. 이 패턴은 여러 가로 섹션을 통해 일관성있는 것입니다. 삽입하는 동안 정확하게 물고기를 위치하는 것이 중요 신장 tubules의 완벽한 가로 섹션을 얻기 위해서입니다. 섹션을 비교하면, 가슴 지느러미와 근위 뒤얽힌 tubules은 해부 학적 마커로 사용됩니다.

그림 1. 콩팥 세포 독소의 microinjection. 일반 추기경 정맥, 흰색 화살표 희미한 표정으로 루시퍼 노란색으로 복합 10kDa dextran의 (A) 성공 분사. (B), 순환 시스템, 빨간색 화살표로 분산되지 않습니다 루시퍼 노란색으로 복합 10kDa dextran의 보증금에 잘못 주사 결과.

그림 2. Gentamicin - 중재 부종. (A) 컨트롤 애벌레 zebrafish를 주입했다. Gentamicin은 (B) 중간 또는 (C) 심한 부종과 애벌레 zebrafish를 주입했다. 모든 애벌레가 왼쪽으로 앞쪽에 4 개의 DPF에 있으며, 지느러미가있다. 블랙 화살표는 B와 C에 pericardial 부종을 가리킨

그림 3. 아키 immunohistochemistry. 컨트롤에 나 ⁺ / K ⁺ ATPase 48시간 - 게시 gentamicin 분사 (4 DPF의 애벌레) (A, B)과 gentamicin의 주입 (C, D) 유충에 대한 α - 6F 항체 염색법. A, C는 basolateral 극성 및 D에 가느다란 관 장애, 흰색 화살표의 A와 C. 참고 손실의 오른쪽 tubules의 3 배 디지털 배율은 B.에 비해 20X 확대와 B와 D의입니다

토론

이 동영상이 문서에서 우리는 zebrafish 애벌레에서 gentamicin 중재 근위 관형 손상을 작성하여 아키 모델에 정맥 microinjection 기술을 시연했다. pericardial 및 / 또는 총 부종의 형성이 손상 결과, 물의 균형을 조절하는 무능력을 반영. 우리는 또한 세포 극성의 손실 및 손상 신장의 근위 가느다란 관의 파괴를 보여주는 차별화된 신장 tubules을 (Majumdar 외. 2000) 마르크 항체와 immunohistochemistry 실험을 설명했다. 정맥 microinjections은 zebrafish 애벌레의 혈류에 가용성 물질을 전달하기위한 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 기술은 물질의 다양한 도입을위한 훌륭한 도구이며, 형광 마커 유니폼 주사의 도움과 일치 결과에 대한 허용을 통해 여러 번 반복 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope