Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

Resumo

Descrevemos uma técnica de microinjecting a aminoglicosídeos, gentamicina, em dois dias pós-fetilization (dpf) larvas de peixe-zebra para induzir lesão renal aguda (IRA). Nós também descrevem um método para montar toda a imunohistoquímica, plástico incorporação e secção de larvas de peixe-zebra para visualizar os danos mediados AKI.

Resumo

Neste artigo de vídeo descrevemos um modelo de zebrafish AKI utilizando gentamicina como o nephrotoxicant. A técnica consiste em microinjeções intravenosa em 2 zebrafish dpf. Esta técnica representa um método eficiente e rápido para entregar substâncias solúveis na corrente sangüínea de larvas de peixe-zebra, permitindo a injeção de peixes 15-20 por hora. Além AKI estudos, esta técnica de microinjeção também pode ser usado para outros tipos de estudos experimentais, como a angiografia. Nós fornecemos um protocolo detalhado da técnica de equipamentos necessários para medidas visuais da função renal diminuída. Além disso, também queremos demonstrar o processo de fixação imunohistoquímica montagem, toda com um marcador túbulos renais, a incorporação de plástico e secção do peixe-zebra larval. Nós demonstramos que larvas do peixe injetada com gentamicina mostram características morfológicas consistentes com AKI: edema, perda da polaridade celular em células epiteliais tubulares proximais e interrupção morfológica do túbulo.

Protocolo

Parte do protocolo que se segue é baseado em métodos publicados relatado por (Hentschel et al. 2005) e (Weinstein et al. 1995) com ligeiras modificações.

Parte 1: Microinjeções

Configurar com antecedência para microinjeção

• Os peixes são injetadas em dois dias pós-fertilização (DPF). Portanto, peixe-zebra adulto são criados três noites antes de um experimento planejado. Coletar embriões e colocá-los em uma placa de Petri com água E3 (NaCl 5mM, 0.17mm KCL, CaCl ₂ 0,33 mm, 0,33 mm MgSO ₄₎ a 28,5 ° C. No final do primeiro dia remover embriões mortos da placa de Petri e embriões separados para que não haja 8-10 embriões por placa de Petri.
• Prepare as agulhas de vidro puxando a partir de tubos capilares (4 centímetros de comprimento, 0,63 / 0,20 OD / ID milímetros (mm) R-6 Personalizado de vidro Tubulação Drummond sociedade científica, Broomall, PA 9-000-3000) com um puxador de eletrodo. O diâmetro da ponta deve ser de 10-20 mM. Sob um microscópio de dissecação (Leica S6E), com um marcador permanente desenhar cerca de 10 linhas de um milímetro ao longo da agulha, com a ajuda de uma régua, e armazenar as agulhas em um prato de Petri grande em rampas de barro.
• Prepare a pipeta holding: Fire-polonês a ponta de um tubo de vidro de paredes finas borosilicato capilar (152 mm, 1 / 0,75 OD / mm ID TW100-6, Instrumentos de Precisão World, Inc.) com uma chama bico de Bunsen até que o diâmetro interno de a dica é 0,4-0,5 mm. Essa dimensão permite boa aderência do saco vitelino de larvas de peixe-zebra 2 dpf. Segure uma extremidade de um pedaço de vidro capilar usando uma pinça longa, eo calor da ponta oposta com do capilar com o bico de Bunsen, colocando-o verticalmente sobre o cone azul luz interior da chama, a parte mais quente, por 1-2 segundos, implantá-la para obter um mesmo derreter. Repita isso algumas vezes, em seguida, examinar o capilar sob o microscópio, em um micrômetro de estágio (94 de Ward W 9910). Esta é uma etapa crítica, pode ser necessária para disparar um polonês-pipetas segurando poucos e selecione o tamanho apropriado mais tarde, enquanto você está manipulando as larvas. Se você é cuidadoso, segurando uma pipeta tem a duração de sessões de microinjeção múltiplas.
• Encha a bomba Microsseringa Manual (MMP, Precision Mundial Instruments, Inc.), com óleo mineral, seguindo as instruções dadas pelo fabricante. O titular da pipeta é inserido em um manipulador joystick (Narishige, MN-151), ligado com um suporte magnético (Narishige, MN 151) a uma chapa de ferro (Narishige, IP).

Microinjeção

• Prepare 20μl da mistura de injecção:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml em solução salina) e 10 kDa 17.6μl-lucifer amarelo dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml em solução salina) No peixes controlar o gentamicina é substituído por solução salina. O dextran fluorescente (muitas cores diferentes podem ser usados) é suficiente para verificar a precisão da injeção e selecione larvas que foram injetados com a nephrotoxicant.
• Prepare duas placas de Petri 30 milímetros com óleo mineral 2ml para colocar a mistura de injeção e mistura sob controle, para evitar a evaporação das soluções.
• Prepare o anestésico: 400 mg tricaina pó (etil-m-aminobenzoato metanossulfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml de água DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Ajustar a pH 7. Conservar a solução estoque no freezer, em alíquotas de 4,2 ml. Para usar tricaina como um anestésico diluir a 4,2 ml solução estoque tricaina em 100 ml de água E3 (Westerfield 1993) e deixar à temperatura ambiente.

As seguintes etapas são realizadas sob um microscópio de dissecação

• Remover manualmente qualquer córions restantes com uma pinça fina e anestesiar o peixe-zebra transferindo-os em um prato de Petri com tricaina aquecido em temperatura ambiente. Peixe-zebra deve ser exposto a tricaina pelo menos 15 minutos antes de iniciar o microinjeções.
• Abra a ponta da agulha de injeção usando uma lâmina de barbear (VWR científica 55411-050). Segure a lâmina com uma ligeira inclinação para criar um chanfro e cortar a ponta, como para obter uma abertura de cerca de diâmetro de 10 20Hm.
• Ligue vácuo de poder, e suprimento de ar do aparelho de microinjeção (World instrumentos de precisão Inc., PV820 pneumáticos picopump). Inserir a agulha no porta-agulha montada sobre a base de micromanipulador e inclinação (Instrumentos Palavra Precision, Inc., Modelo M3301R, TB-1).
• Para preencher a agulha, coloque uma gota (10μl) da solução a ser injetado na placa de Petri 30 milímetros preenchido com óleo mineral (Fisher Chemicals, 0121-1). Vire o micromanipulador manual de forma a submergir a ponta da agulha na gota de solução, defina o picopump "hold / vent" mudar para "desabafar" ("vent" equivale a vácuo no PV820), e preencher a agulha, puxando solução através da ponta da agulha. Isso levará alguns minutos, se a solução entra na agulha muito rápido,isso significa que o diâmetro da ponta é muito grande, e as injeções não serão precisos. Após a agulha é preenchido, defina a picopump para "hold" ("hold" equivale a injetar no PV820).
• Para calibrar a agulha, defina o picopump "gated / timed" mudar para "gated", pressione o pedal para descarregar a agulha, e gravar o tempo que leva (segundos) para o menisco para viajar de uma marcação para o próximo (1 distância total mm). Repita 3 vezes, o tempo médio (em segundos), e dividir o valor por 30 (volume em nanolitros (nl) correspondente a 1 mm de distância linear) para determinar o número de milissegundos necessários para entregar um nl de solução. Ajuste o botão período de intervalo para este número e mover o "gated / timed" mudar para "cronometrado". Agora, o picopump está definido para entregar um pulso 1nl de solução.
• Retire o prato de óleo mineral ea posição do prato de Petri com as larvas sob o microscópio. Grupo o peixe no centro da placa de Petri e foco.
• Coloque a pipeta holding na bomba de micro-manual (MMP, instrumentos de precisão Mundial) no lado oposto do microinjetor, antecipadamente sua ponta para a placa de Petri, e no plano de foco do microscópio. Dobrá-lo com um ângulo bastante superficial, de modo que a ponta da pipeta holding é tocar o fundo da placa de Petri e está perto de horizontal. Certifique-se de não ter qualquer bolha de ar no sistema, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão da MMP.
• Mudar para uma maior ampliação no microscópio e usar um cílios superfino com alça (Ted Pella 113) para posicionar o lado dorsal das larvas de peixes para baixo com a gema muito perto da pipeta holding. Segure o peixe larval sugando a gema na pipeta holding girando anti-horário na unidade micrômetro controlar a bomba micro manual. Tome cuidado para não transformar o micrômetro longe demais, como a gema pode estourar se puxou muito profundo para a pipeta holding. Foco na veia cardinal comum, formando, que se encontra sobre a gema, logo abaixo da periderme e é o local do fluxo sanguíneo muito elevado. Com o micromanipulador do aparelho de injeção, guiar a agulha para o desenvolvimento comum veia cardinal. É tipicamente necessário retirar a agulha um pouco para trás após a inserção, como a veia cardinal comum é muito superficial. Injetar 1nl de solução pressionando o pedal, em seguida, solte as larvas da pipeta holding e devolvê-lo à água embrião. Esta é uma etapa crítica, especialmente pela primeira vez, porque requer uma certa quantidade de prática no posicionamento do peixe e controlar a sucção e pressão do equipamento. Se a gema do embrião é adequadamente realizado, com a pipeta de holding, que não vai rolar como a agulha entra.
• Para verificar o sucesso da microinjeção, monitorar a presença do amarelo lucifer dextran no coração do peixe zebra em um microscópio fluorescente. O amarelo lucifer permanece visível no coração durante aproximadamente 20 minutos antes de se dissipar para o sistema circulatório Se a solução é injetada nefrotóxicos corretamente, dentro de 2 horas da injeção você vai ver muito pouco lucifer amarelo dextran restantes no local da injeção. Se a solução é injetada no saco vitelino, um ponto de lucifer amarelo dextran permanecerá no local da injeção. (Fig. 1). Devolver o peixe ao meio E3.
• Dois dias após a injecção, as larvas se desenvolvem edema de pericárdio como conseqüência da diminuição da função renal (Fig. 2).

Parte 2: Fixação e imunofluorescência com Na ⁺ / K ⁺ ATPase de anticorpos (α-6F)

• Em 4 dpf, coloque entre 10 e 15 zebrafish larval em frascos de vidro 4ml (Weathon, 225.012) e corrigi-los em 1ml Dent (80% MeOH DMSO 20%) por 4 horas à temperatura ambiente.
• Hidratar os embriões em um MeOH classificados / PBT (PBS com 0,5% Tween20) série, 75:25 50:50, 25:75, PBT 100%, pipetagem a solução para fora e adicionando nova solução para o frasco do mesmo (1 ml de solução por frasco), 20 minutos em cada solução. Larvas nunca deve ser exposto ao ar, deixe uma solução pouco cobrindo as larvas quando mudar soluções.
• Remover e substituir PBT 1ml com solução de bloqueio (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, soro de cabra 10% normal) durante 3 horas a 4 ° C em um nutator.
• Transferência das larvas em uma microcentrífuga 2ml. Remova o bloqueio de soro e substituir com o anticorpo primário 300 ul em solução de incubação (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, 2% soro de cabra normal) durante a noite a 4 ° C em um nutator. Nós usamos um anticorpo monoclonal Na ⁺ / K ⁺ ATPase de anticorpos (α-6F, sobrenadante, Estudos de Desenvolvimento Hibridoma Bank, Iowa) na diluição de 1:25
• Remover o anticorpo primário e lavar 3 x 30 minutos com solução de incubação à temperatura ambiente.
• Incubar com anticorpo secundário (cabra anti-camundongo Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluído 1:500 em solução de incubação por 2 horas aRT.
• Lavar 3 x 30 minutos com PBT.

Parte 3: incorporação de plástico com JB-4

• Desidratar tecidos através de uma série de etanol classificados (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minutos por etapa.
• Preparar a solução de infiltração: 25 ml de JB-4 Solução Incorporação A (Polysciences 0226A) e 0,24 g de catalisador (Polysciences 02.618). Demora um tempo para o catalisador para dissolver, cerca de 20-30 minutos. A solução pode ser armazenada a 4 ° C até 1 mês.
• Decantar o etanol 100% e substituir com a solução de infiltração de plástico. Colocar os tubos a 4 ° C em um rotador e permitir a infiltração de prosseguir até que o dissipador de larvas para o fundo do frasco de vidro. Este processo geralmente leva cerca de 30 minutos.
• Incorporação de protocolo: Coloque a bandeja de copo de plástico de moldagem (Polysciences, Inc. 16643A) sob um microscópio de dissecação. Transferir as larvas, junto com a solução de infiltração para cobrir, para os copos. A mídia incorporação de plástico é preparado em um pequeno tubo de plástico. Nós normalmente incorporar 4-5 peixes de cada vez, um peixe para cada xícara. Prepare 5-6 ml de plástico incorporação (1,2 ml de solução de incorporação para cada copo) a adição de 35 mL de JB-4 Incorporação Solução "B" (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Adicionar 35 mL de JB-4 Solução Embedding "B" (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Misture bem, pipetando para cima e para baixo com um plástico vezes pipeta Pasteur diversas. Isto é importante porque se não for bem misturada o JB-4 não irá polimerizar adequadamente. Depois de 5ml de plástico incorporação foi preparado, retire a infiltração de plástico de cerca de amostras com uma pipeta Pasteur. Encha o copo com a incorporação de plástico. O plástico deve sair fora do copo, para garantir uma boa pega do titular bloco para o espécime. Para detectar zebrafish túbulos renais, as seções transversais são as melhores. Para este fim, os peixes são incorporados na vertical, cabeça para baixo. Com a ajuda de um cílio com alça fina ou fórceps, periodicamente a posição do peixe na vertical, até que o plástico é duro o suficiente para que eles não se movem a partir de sua posição. Demora cerca de 20-30 minutos. Então, coloque o Titular EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15.899) sobre os copos e deixe a bandeja a 4 ° C durante a noite. Quando polimerização em completa, você pode sair como os blocos de cubos de gelo.
• Protocolo de incorporação de múltiplas alternativas para as larvas: Encha até a metade com moldes completa JB-4 e deixe-a polimerizar. Para os 15 milímetros quadrados moldes usamos o volume JB-4 em 700μl para encher o molde pela metade. Em seguida, adicione as larvas JB-4 embebido com endurecedor para a pré-polimerizado meio-cheio moldes. Orientar as larvas com a cabeça apontando para o lado mais longo do molde e alinhar as larvas para que o line up olhos (você pode colocar 10 peixes em um único molde em uma linha). Depois que o bloco é polimerizado você pode cortar as bordas do bloco, transformá-lo de modo que o lado está a enfrentar a faca e super cola-lo para um plástico "chuck" que se encaixa no micrótomo. Com este método você pode posicionar um grande número de larvas no mesmo bloco, centrado no plástico, e pronto para seções transversais. O cuidado deve ser tomado orientar o bloco para a faca de modo que as seções equivalentes de cada peixe são tomadas em uma única seção. Isso pode ser feito enquanto o corte através dos olhos, ou seja, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. O resultado final é que você pode analisar muitos peixes concomitantemente em uma única lâmina de microscopia.

Parte 4: Seccionamento

• Definir a amostra no suporte chuck do micrótomo (usamos um Shandon Finesse Thermo Electro Corporação micrótomo)
• Definir o slide mais quente a 45 ° C.
• Despeje a água DI, para um copo e coloque-o perto do micrótomo
• Antes de seccionamento, certifique-se o bloco é orientada de modo a se obter perfeita secções transversais do peixe. A orientação alavancas de ajuste de cabeça pode ser girada permitindo que a posição do cabeçote da amostra com precisão para a faca. Iniciar o corte de espessura através da cabeça do peixe. Enquanto o corte através dos olhos, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. Quando as barbatanas peitorais aparecem nas seções, que é quando os túbulos pronephric começar. A partir deste ponto, cortar cerca de 32 hm 4 seções do bloco.
• Recolher as seções com uma pinça e deixe-as cair no copo com água, sem tocar a água com a pinça. A seção vai expandir assim que atinge a superfície da água, agora você pode cobrá-lo em um slide. Inserir o slide para a água em um ângulo de 45 ° e abordagem a seção com a ajuda de um cílio com alça, tocando só as fronteiras da seção.
• Incubar as lâminas em um slide mais quente até que esteja completamente seco.
• Seções imagem usando microscopia de epifluorescência ou confocal.

Parte 5: Representante Results

Quando realizada corretamente, peixes injetados aparecer como na figura 1, com pouco fluorescentes dextran (neste caso, Lucifer Yellow) visível no coração e no sistema circulatório. Se a injecção é muito profundo, material injetado pode ser visto concentrada no saco vitelino, ou o coração pode ser perfurada causando sangramento excessivo. Se a pipeta holding é feita corretamente, o peixe não vai rolar ou mover quando injetado, e isso vai permitir uma injecção mais precisas. Além disso, é importante certificar-se de não ter qualquer bolha de ar no PDM, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão do sistema. Geralmente, como conseqüência de nefrotoxicidade gentamicina, 80% dos peixes injetados desenvolver edema de pericárdio (Fig. 2). Usamos um sistema de classificação baseado fenótipo, em que os peixes com edema moderado mostrar edema de pericárdio evidente, mas os outros não observáveis ​​fenótipos, enquanto que os peixes severamente edematoso mostrar edema pericárdico e tronco, com ligeira a moderada curvatura do eixo. Usando um anticorpo contra o túbulo renal Na ⁺ / K ⁺ ATPase (α-6F) podemos visualizar os túbulos danificado em seções transversais, com uma perda evidente de polaridade celular e interrupção tubular nos túbulos danificado em comparação aos controles (Fig. 3). Este padrão é consistente através de múltiplos cortes transversais. A fim de obter perfeita secções transversais dos túbulos renais é importante para posicionar o peixe corretamente durante a incorporação. Ao comparar seções, nadadeiras peitorais e túbulos proximal convoluted são usados ​​como marcadores anatômicos.

Figura 1. Microinjeção nefrotoxina. (A) de injeção de sucesso de um dextran 10kDa conjugado com lucifer amarelo, com expressão fraca na veia comum cardinal, seta branca. (B) a injeção incorreta, resultando em um depósito de 10kDa dextran conjugado com amarelo lucifer que não se dissipa para o sistema circulatório, seta vermelha.

Figura 2. Gentamicina mediado edema. (A) Controle injetado zebrafish larval. Gentamicina injetado zebrafish larval com (B) ou moderada (C) edema grave. Todas as larvas são menos 4 dpf com anterior para a esquerda e dorsal é para cima. Setas pretas apontam para edema pericárdico em B e C.

Figura 3. AKI imuno-histoquímica. α-6F coloração de anticorpos para ATPase Na ^{+ +} / K-48 horas após a injecção de gentamicina (4 larvas dpf) no controle (A, B) e injetados gentamicina (C, D) larvas. A, C estão em 20X de ampliação e de B e D são 3X ampliações digitais dos túbulos direito em A e C. Nota perda de polaridade basolateral e ruptura dos túbulos, seta branca, em D, em comparação com B.

Discussão

Neste artigo de vídeo demonstramos uma técnica de microinjeção intravenosa por um modelo de LRA, através da criação de gentamicina danos proximal mediada tubular em larvas do peixe. Este dano resulta na formação de pericárdio e / ou edema bruto, refletindo uma incapacidade de regular o equilíbrio hídrico. Nós também descreveu um experimento imuno-histoquímica com um anticorpo que marca túbulos renais diferenciados (Majumdar et al. 2000), mostrando a perda da polaridade celular e uma interrupção do túbulo proximal nos rins danificados. Microinjeções intravenosa representam um método eficiente para a entrega de uma substância solúvel na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra. Esta técnica é uma excelente ferramenta para a introdução de uma variedade de substâncias e com a ajuda de uma injeção uniforme marcador fluorescente pode ser repetido muitas vezes permitindo a resultados consistentes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope