마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

요약

midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에 사용됩니다 체외에서 분석. 본 분석에서는 axonal 파생물 및지도는 조작과 계량 수 있습니다. 그것은 또한 다른 지역이나 분자 단서를 평가에 대해 수정할 수 있습니다.

초록

striatum ^한 포함한 telencephalon 여러 분야에 대한 중간 forebrain 번들 통해 Midbrain의 도파민 (mdDA) 뉴런 프로젝트. 서로, striatonigral (직접) 경로를 야기할 striatum에서 매체 가시 뉴런은 substantia nigra ² 신경을 분포시키다. 이러한 축삭의 책자의 개발은 축삭의 성장과 neurites하거나 (중급) 대상 지역 ^3,4에 의해 출시되는 분자를 포함하여지도 단서의 과다의 조합 동작에 의존적일 수 밖에 없습니다. 이러한 수용성 요소는 세포외 환경을 흉내낸 axons에 대한 입체적인 기판을 제공하는 콜라겐 매트릭스의 culturing의 mdDA 및 / 또는 striatal explants하여 체외에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스 주변 (예 : 참고 문헌 5와 6 참조)에 배치 기타 explants이나 세포가 발표한 단백질의 상대적으로 안정적인 그라디언트의 형성을 허용합니다. 여기 pur를위한 방법을 설명콜라겐 젤류 및 후속 immunohistochemical 및 정량 분석​​에 쥐의 꼬리 콜라겐, dopaminergic 및 striatal explants의 microdissection, 그들의 문화 ification. 첫째, E14.5 마우스 배아의 두뇌는 고립된 dopaminergic이며 striatal explants는 microdissected됩니다. 이러한 explants 그 후 (CO) 체외에서 48~72시간 동안 coverslips에 콜라겐 젤에 배양해 있습니다. 그 후, axonal 전망이의 연결을 표시 (예, 티로신 hydroxylase, DARPP32 또는 βIII의 tubulin)과 축삭의 성장과 매력적이거나 혐오스러운 장면 축삭 댓글의 계량하고 사용하여 시각입니다. 이것의 연결 준비는 개발하는 동안 mesostriatal 및 striatonigral 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 체외 연구에 대한 유용한 도구입니다. 이러한 분석을 사용, 그건 dopaminergic 및 striatal axons 기타 (중급) 목표를 평가하기 위해 또는 특정 분자 단서를 테스트할 수도 있습니다.

프로토콜

1. 쥐 꼬리 콜라겐의 작성

1. 6-10 성인 쥐의 꼬리를 (이것은 사용할 때까지 -20 ° C에 꼬리를 저장할 수 있습니다)를 수집합니다.
2. 실온 (RT)에서 하룻밤 사이에 95 % 에탄올에 꼬리를 적시게.

쥐의 꼬리의 절개 (조직 문화 후드에서) :
(그들을 사용하지 않을 때 70 %의 에탄올에 도구를 유지하고이 절차 전반에 걸쳐 사용되는 모든 솔루션, 도구 및 유리 제품은 멸균 있는지 확인)

3. 꼬리에서 힘줄를 수집하려면, 꼬리 끝부분을 잘라. 포셉 한 켤레와 꼬리의 큰 끝을 잡아. , 잡고 구부 및 기타 포셉 가까운 꼬리를 끊어야 할 포셉 또 한 쌍의을 사용합니다. 떨어져 당겨와 힘줄 (그림 1A, B) 뒤에 남아있을 것입니다.
4. 멸균 H ₂ O에 힘줄를 수집하고 모든 힘줄을 수집 후 멸균 H ₂ O를 가진 새로운 petridish으로 이동
5. 2-3 힘줄을 가지고 2 쌍 중을 사용하여 분쇄기에 넣어멸균 H ₂ O에있는 새로운 petridish에 ceps 이러한 정맥 (; 그림 1C 힘줄 조직이 반짝 이는 반사이다)로 비 힘줄 조직을 제거합니다. 모든 비 힘줄 조직을 제거 후, ​​각각의 꼬리는 힘줄의 약 100-150 MG를 얻을.
6. 멸균 3퍼센트 초산 300 ML에 힘줄을 전송하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C.
7. 멸균 3퍼센트 초산의 추가 200 ML을 추가하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C.
8. 4에 120 분 동안 ~ 2,700 XG에 힘줄이 들어있는 아세트산 용액을 원심 ° C 펠렛 이외의 해산 힘줄이 아닌 힘줄 조직합니다.
9. 원심 분리하는 동안 투석 튜브가 준비 :
   • 40cm의 조각 잘라
   • 5 분, 500 μm의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 넣어 익히지
   • 멸균 H ₂ O 시원하고
10. 투석 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶게하고 자동 pipett를 사용하여 조직 문화 후드 얼음 속에서 centrifuged 힘줄이 솔루션의 표면에 뜨는 함께 튜브를 채우려면전자과 25 ML의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오. 매듭은 튜브의 모든 조각들은 (그림 1D) 얼음 무균 알루미늄 호일에 튜브 및 매장 튜브의 다른 쪽 끝을 가득 때까지.
11. 조직 문화 후드에 무균 0.1X MEM, 산도 4.0의 10 나도 준비합니다. 튜브 조각에 시체를 추가하고 10 난 비커에 미리 냉각 0.1X MEM 용액에 이들을 추가합니다. 천천히 교반 ° C ~하면서 4에서 하룻밤 Dialyze. 산도가 낮은 유지하면서 이러한 투석은 초과 산성을 제거합니다.
12. 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM로 교체 및 4에서 하룻밤 저어 ° C.
13. 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM으로 대체하여 이전 단계를 반복하고 4에서 하룻밤 저어 ° C.
14. 멸균 50 ML 튜브로 나누어지는의 콜라겐 솔루션입니다. 4 ° C.에 상점 aliquots 6-12 개월을 유지, 오직 조직 문화 후드에 콜라겐 주식을 취급하고 있습니다.
15. 그것은 정화 콜라겐은 콜라겐 matr에서 최적의 결과를 얻으려면 (0.1x MEM)을 희석해야 여부를 테스트하는 것이 중요하다IX 분석. 따라서 콜라겐 희석 시리즈를 생성 (undiluted 콜라겐, 1시 1분, 1시 2분 및 1시 5분이 희석)와 최적의 콜라겐 희석을 결정하기 위해 아래에 설명된대로 콜라겐 매트릭스 assays를 수행합니다.

2. Dopaminergic Midbrain ^7,8의 해부

1. 어머니의 자궁에서 E14.5 마우스 배아를 해부하고 필요할 때까지 얼음 L15 매체에 보관.

모든 후속 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다.

2. 두뇌를 해부.
3. 각 telencephalic 소포 (striatal explants 위해 telencephalic vesicles을 사용)의 중간 부분을 따라 절단하여 telencephalon를 제거합니다.
4. meningeal 칼집을 제거합니다.
5. mesencephalic 굴곡의 단지 주동이의 dorsoventral 몫을합니다.
6. mesencephalic 만곡 중 꼬리 다른 dorsoventral 몫을합니다.
7. microdissectio을 사용하는 등 부분의 중간선을 따라 rostrocaudal 컷 만들기n은 칼로 기본 복부 midbrain 조직을 폭로합니다. 그것이 dopaminergic 뉴런 (그림 2)가 들어 있으므로 복부 midbrain 조직에 충돌하지 않도록주의하십시오.
8. 이 rostrocaudal 인하는 수평과 지느러미 midbrain 조직을 제거하는 복부 중간선에 평행합니다.
9. microdissection 나이프를 사용 explants로 남아 복부 midbrain 조직을 나누십시오.
10. 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다.

3. Striatum의 해부

모든 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다.

1. midbrain의 해부 동안 해부 telencephalic vesicles을 사용합니다.
2. 시상과 집게를 사용하여 striatum 사이에 절단하여 시상을 제거합니다.
3. 이러한 후각 망울로 주동이의 구조를 제거 striatum에 mediolateral 상처가 주동이의합니다. striatum에 caudally있는 조직에 대해이 단계를 반복합니다.
4. 위치striatum의 코로나보기를 얻을 수 남은 ​​슬라이스 (그림 2).
5. striatum는 조직 (더 투명) 약간은 덜 조밀한 부분으로 인식된다. microdissection 나이프를 사용 explants로 striatum과 상처를 해부. 측면과 중간 ganglionic 예하의 이주 뉴런을 포함 중간선에 약간 어두운 조직 주변을 피하십시오.
6. 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다.

4. 조립 콜라겐 매트릭스 Assays

콜라겐의 준비 (얼음의 모든 단계, 피펫 팁에게 냉각 사용)를

1. 10X MEM 100 μl와 1M 나트륨 중탄산염 40 μl (NaHCO _3)로 희석 콜라겐의 860 μl를 섞어서 얼음에 보관. 이 시점에서 콜라겐가 따뜻해지면 그것은 고체화됩니다.
2. 4 잘 Nunc 요리의 우물로 coverslip에 준비된 콜라겐 20 μl의 방울 (직경 약 5 ㎜) 추가그리고 37 CO ₂ 배양기에 서 해주 ° C ~ 5 % 30 분 (주위 O ₂ 농도가 충분합니다)에 대한 CO _2. 이 인큐베이션 기간 동안 콜라겐은 아교 질로 만들다 것입니다.

콜라겐 겔에서 설치 프로그램 공동 문화

3. 콜라겐은 gelatinized 후 콜라겐으로 dopaminergic 또는 striatal explant를 전송하는 200 μl 팁과 피펫을 사용합니다.
4. 바늘을 사용하여 서로 근접 거리에 explants 이동합니다. 한 explant (~ 200-300 μm의) (그림 2)의 약 직경의 거리에서 그들을 따로 보관.
5. 초과 매체를 제거하고 explants 위에 준비된 콜라겐 20 μl를 추가합니다. 이것은 종종 explants가 이동하게됩니다. 4.4에서 설명한대로 바늘을 사용하여 explants를 재지정.
6. 콜라겐은 37 ° C 5 % CO _2시 30 분 뒤에 RT에서 15 분 동안 응고하자.
7. 콜라겐가 설정되면, 전자의 400 μl를 추가할xplant 매체 37시 CO ₂ 배양기에서 2-3 일동안은 성장 ° C에서 5 % CO _2.

5. Immunohistochemistry과 부량에 의한 분석

Immunohistochemistry

1. explants를 해결하려면 부드럽게 매체 400 μl (이를 4퍼센트로 PFA를 diluting)에 PBS에서 8 % paraformaldehyde 400 μl (PFA)를 추가하고 RT에서 1 시간 동안 서 보자.
2. RT에서 PBS의 3 배 15 분 씻으십시오.
3. 버퍼를 차단에 품어 (BB, PBS + 1% FBS + 0.1 % 트리톤 X-100) 2 시간.
4. 4 ° C.에서 BB의 일차 항체와 하룻밤 품어 dopaminergic axons은 striatal axons 방지 DARPP32 항체 (1:500) ⁹ 및 모든 axons 방지 βIII의 tubulin (1:3000) ⁷ 시각화를위한 안티 - 티로신 hydroxylase 항체 (1:1000) ^7을 사용하십시오.
5. RT에서 PBS에 5 배 1 시간 씻는다.
6. 4에서 하룻밤 BB의 해당 형광단 (1:500)에 복합 이차 항체와 함께 품어° C. 이 단계에서 explants의 노출을 최소화의 빛으로 (예 : 알루미늄 박으로 그들을 포함).
7. 4에서 PBS에서 하룻밤 씻으 ° C ~ 다음 날 동안 여러 세차장으로 따라갔다.
8. 현미경에 explants를 탑재은 Antifade 시약이 매체를 장착 연장 사용하는 슬라이드. 유리 현미경 슬라이드에 ~ 10 μl의 방울을 추가합니다. coverslip을 가지고 부드럽게 아래로 향하게 explant 측면에 장착 매체의 드롭에 배치하십시오. 아주 부드럽게 장착 매체의 드롭 그것을 낮추는 방법으로 드 coverslip에 따른 공기를 포집하지 마십시오.

P / D 비율을 계산하여 부량

9. epifluorescence 현미경 (그림 3)를 사용 explants의 디지털 이미지를 습득.
10. 이러한 이미지를 사용하여, 근위 사분면 (인접 explant에 가장 가까운 explant의 예 부분)과 말초 사분면 (인접 expla에서 떨어져 멀리 explant의 일부를 생성하는 quadrants으로 각 explant을 나누다NT) (그림 2, 4).
11. 근위 및 말초 quadrants의 두 explant에서 신흥 20 긴 neurites의 길이를 측정합니다.
12. 각 개별 explant에 대한 P / D 비율을 계산하는 20 긴 neurites의 평균 길이를 사용합니다. 비율 <1 축삭의 반발을 표시하면서 AP / D 비율> 1, 축삭의 명소를 나타냅니다.
13. 어떤 경우에는 neurites의 울창한 성장은 개별 neurite 길이의 평가를 방지합니다. 이러한 상황에서는 부량는 explant의 가장자리와 근위 및 말초 quadrants의 축삭 성장의 선도 전면 사이의 거리를 측정하여 수행할 수 있습니다.

6. 대표 이미지

dopaminergic 및 striatal explants의 성공적인 문화 후에는 axons의 큰 숫자 (표시되지 않음) 명시야 현미경을 사용하여 표시하거나 방지 βIII tubulin의 immunocytochemistry 의해 같은 시각입니다. 이러한 axons의 하위 집합이 dopaminergic 또는 S 것입니다 시각을 사용 immunocytochemistry 같은 triatal axons (그림 3). 설명된대로 quadrants로 explants 나누어 및 P / D 비율을 결정함으로써, putative 축삭 매력적이거나 혐오스러운 장면 효과 (그림 3E) 계량하실 수 있습니다.

그림 1. 쥐의 꼬리 힘줄의 콜라겐의 준비를 보여주는 사진. 쥐의 꼬리를 갈라 이겠지)는 힘줄을 제공합니다. B) 인대는 밧줄과 같은 번들로서 볼 수 있습니다. C) 인대는 그들의 반짝 이는 흰색 외관에 의해 정맥에서 구별하기 쉽습니다. D) 초산에 힘줄을 해소 후 솔루션은 투석 튜브로 전송됩니다. 녹아 콜라겐 추위를 유지하려면, 튜브는 얼음에 무균 알루미늄 호일에 표시됩니다.

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그림 2. 절차의 여러 단계를 나타내는 도식. 적절한 뇌 영역 해부와 explants를 생성합니다 버렸어요. 단일 midbrain 및 striatal explant는 콜라겐 매트릭스의 근접 거리에 위치하며 37 ° C.에 48~72시간 동안 성장 남아 있습니다 Axons는 형광 immunohistochemistry에 의해 시각이며 P / D 비율은​​ chemotropic 응답을 수치 계산됩니다.

그림 3. 콜라겐 매트릭스 문화 축삭의 성장을 보여주는 대표적인 결과. ) Midbrain의 explant는 안티 - 티로신 hydroxylase 항체가 축삭의 가지를 밝히 물들일. 점선은 인접한 explant을 나타냅니다. 보여주는 개별 neurites과 성장 콘 (화살표)의 B) 확대. C) Striatal explant 안티 DARPP32 물들일. D) C의 확대는 개별 neurites을 보여주는. 의 E) 예P / D 비율 부​​량. Explants은 동일 quadrants으로 나뉩니다. 말초 사분에서 멀어 직면하는 동안 근위 구역이 인접한 explant에 직면하고 있습니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.

토론

콜라겐 매트릭스 분석은 여기 설명 (예 : 참고 문헌 5-8 참조) 축삭 유도 분자와의 연결 시스템의 다양한 조사를 위해 지난 수십 년간의 여러 연구소에서 사용하고 향상되었습니다. 이러한 연구는이 분석은 효과와 다른 (중급) 대상 조직을 통해 분비 축삭 유도 분자 규제를 공부를위한 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다.

그러나, 그것은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경 (E...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소태아 세럼	BioWhittaker	14-801F
글루타민 (200mM)	PAA	M11-004
Hepes	VWR 인터내셔널	441476L
β-메르 캅 토 에탄올	머크	444,203
최소 필수 미디어 (MEM)	Gibco	61100-087
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504-044
Leibovitz의 L-15 중간	Gibco	11415-049
페니실린 - 스트렙토 마이신	Gibco	15070-063
골드 Antifade 시약을 연장	Invitrogen	P36930
투석 튜브	스펙트럼 연구소	132,660
래빗 안티 티로신 Hydroxylase	펠 - Freez	P40101-0
래빗 안티 Darpp32 (H-62)	산타 - 크루즈	SC-11365
마우스 방지 βIII의 tubulin	시그마	T8660
알렉사 형석은 이차 항체를 분류	Invitrogen